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實(shí)驗(yàn)試劑
采用T7? Tag Affinity Purification Kit
T7?Tag抗體瓊脂,。B/W緩沖液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4,，2.7 mM KCl,， 0.137mM NaCl,，1%吐溫-20,，pH7.3 洗脫緩沖液: 0.1M檸檬酸，pH2.2. 中和緩沖液：2M Tris,，pH10.4,。 PEG 20000。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.100ml 含重組表達(dá)質(zhì)粒的菌體誘導(dǎo)后,，離心5000g×5min,，棄上清，收獲菌體,，用10ml預(yù)冷的B/W緩沖液重懸,。
2. 重懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠,，4℃離心 14000g×30min，取上清液,，0.45μm膜抽濾后作為樣品液,。
3. 將結(jié)合T7?Tag抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫,，裝入層析柱中,。
4. B/W緩沖液平衡后樣品液過柱。
5. 10ml B/W緩沖液過柱,，洗去未結(jié)合蛋白,。
6. 用5ml洗脫緩沖液過柱，每次1ml，洗脫液用含150μl中和緩沖液的離心管收集,，混勻后置于冰上,，直接SDS-PAGE分析。
7. 將洗脫下來的蛋白放入透析袋中,，雙蒸水透析24hr,，中間換液數(shù)次。
8. 用PEG 20000濃縮蛋白,。
注意事項(xiàng)
蛋白在過層析柱前,，要0.45μm膜抽濾，否則幾次純化后,，柱子中會(huì)有不溶物,。
