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實(shí)驗(yàn)原理

我們知道微生物都具有生長(zhǎng)旺、繁殖快的特點(diǎn),，單細(xì)胞微生物如細(xì)菌,、酵母菌的個(gè)體細(xì)胞的增大即細(xì)胞物質(zhì)的增加是有限度的，細(xì)胞長(zhǎng)大到 一定程度就開(kāi)始分裂繁殖,，菌體數(shù)量增多,。細(xì)菌旺盛生長(zhǎng)時(shí)幾十分鐘就可繁殖一代。
因此他們的生長(zhǎng)往往是通過(guò)繁殖表現(xiàn)出來(lái)的,，本質(zhì)上是以群體細(xì)胞數(shù)目增加為生長(zhǎng)標(biāo)志,。絲狀微生物如放線菌、霉菌的生長(zhǎng)主要表現(xiàn)為菌絲的伸長(zhǎng)和分枝,，他們相互纏繞,，很難分清個(gè)體與個(gè)體之間的界限，所以通常以菌絲的重量增長(zhǎng)(細(xì)胞質(zhì)量的增加)或菌絲生長(zhǎng)速度間接來(lái)衡量生長(zhǎng)狀況,。目前測(cè)定微生物數(shù)量的方法有直接法和間接法,。直接法包括血球計(jì)數(shù)板法、涂片染色法,、比濁法等,；間接法又包括平皿菌落計(jì)數(shù)法、液體稀釋法、薄膜過(guò)濾計(jì)數(shù)法等,。測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)量的方法有定氮法測(cè),、DNA法、測(cè)定細(xì)胞干重法,、測(cè)定細(xì)胞濕重法,、生理指標(biāo)測(cè)定法等。
為了學(xué)習(xí)微生物的生長(zhǎng)規(guī)律,，增進(jìn)了解微生物生長(zhǎng)旺,、繁殖快的特點(diǎn)，以酵母,、放線菌和黃瓜枯萎病菌作為實(shí)驗(yàn)材料,，本實(shí)驗(yàn)采用了干/濕重法、血球計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù),、比濁法以及菌絲長(zhǎng)度測(cè)量法,測(cè)定了放線菌及黃瓜枯萎病菌的生長(zhǎng)量和黃瓜枯萎病菌的生長(zhǎng)曲線,，繪制了酵母生長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線（細(xì)胞數(shù)密度-OD420）。

實(shí)驗(yàn)試劑

培養(yǎng)基： 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(肉湯培養(yǎng)液)  高氏一號(hào)培養(yǎng)基(液/固)  馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PDA液/固)
試劑： 無(wú)菌水

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

震蕩器 
血球計(jì)數(shù)板(0.10mm  1/400mm2  16×25)
電爐
恒溫培養(yǎng)搖床
普通離心機(jī)
超凈工作臺(tái) 
恒溫培養(yǎng)箱 
手提式高壓蒸汽滅菌鍋 
光學(xué)顯微鏡 
721型分光光度計(jì) 
比色皿 
布氏漏斗 
烘箱 
打孔器 
接種環(huán) 
定性濾紙 
直尺等

實(shí)驗(yàn)材料

菌種：放線菌  釀酒酵母菌 黃瓜枯萎病菌

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 放線菌生物量測(cè)定

  （1）菌絲的生物量測(cè)定——干/濕重法

將從土壤中分離出的放線菌在高氏1號(hào)平板上密集劃線后,，培養(yǎng)一周,。用打孔器打下數(shù)個(gè)菌塊，分別取3片菌塊放入3瓶50ml/250ml高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基中,，1片菌塊放入50ml/250ml無(wú)菌水中,，30℃ 200rpm搖瓶培養(yǎng)一周后用定性濾紙過(guò)濾，收集菌絲,，測(cè)出濕重后,，將菌絲置于80℃烘箱中烘干至恒重，再測(cè)出的菌絲重量即為干重,。

2. 黃瓜枯萎病菌生長(zhǎng)量測(cè)定 

   (1) 菌絲長(zhǎng)度測(cè)量法

通過(guò)測(cè)定菌落生長(zhǎng)的直徑來(lái)估測(cè)黃瓜枯萎病菌的生長(zhǎng)速率。

挑一小塊帶黃瓜枯萎病菌菌絲的培養(yǎng)基接種于PDA平板中央,，培養(yǎng)一周后用直徑0.8cm的無(wú)菌打孔器打下接種至直徑9.0cmPDA平板的中央,，在接下來(lái)的一周內(nèi)每隔12hours測(cè)量一次菌絲的生長(zhǎng)長(zhǎng)度，直到菌絲掩蓋全皿為止,。求出菌絲的平均生長(zhǎng)速率,，并據(jù)此繪制出生長(zhǎng)曲線。

   (2) 菌絲的生物量測(cè)定——干/濕重法

將培養(yǎng)一周的黃瓜枯萎病菌PDA平板用打孔器打下數(shù)個(gè)菌塊,，取3片菌塊分別放入3瓶50ml/250ml PDA液體培養(yǎng)基中,，1片菌塊放入50ml/250ml無(wú)菌水中，30℃ 200rpm搖瓶培養(yǎng)一周后用定性濾紙過(guò)濾,，收集菌絲,，測(cè)出濕重后，將菌絲置于80℃烘箱中烘干至恒重，再測(cè)出的菌絲重量即為干重,。   

3. 酵母生長(zhǎng)量測(cè)定

   (1) 測(cè)定酵母細(xì)胞懸浮液的OD值——比濁法

將酵母接種至肉湯培養(yǎng)液(50ml/250ml)中,，每瓶接一環(huán)，共2瓶,，28℃ 125rpm搖瓶培養(yǎng)兩周,。將培養(yǎng)液分裝入10ml離心管中5000r/min離心5～6min，棄去上清,，再用無(wú)菌水重懸,，離心并棄去上清，重復(fù)2次,，以除去殘留在培養(yǎng)液,。

合并沉淀，用無(wú)菌水按一定比例稀釋為6個(gè)稀釋度,，于420nm處測(cè)量OD值（721型分光光度計(jì)的有效測(cè)量范圍為0.1-0.65）,。

   (2) 測(cè)定酵母懸浮液的細(xì)胞濃度——血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)

洗凈血球計(jì)數(shù)板后將蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)室上，用細(xì)口滴管將其中一個(gè)稀釋度的菌液來(lái)回吹吸數(shù)次,，使菌液充分混勻后立即吸取少量菌液加在蓋玻片的邊緣上,，讓菌液由蓋玻片與計(jì)數(shù)板的縫隙間滲入計(jì)數(shù)室(計(jì)數(shù)室內(nèi)不能有氣泡)。輕壓蓋玻片,，以免因菌液過(guò)多而將蓋玻片頂起而改變了計(jì)數(shù)室的容積,。

靜置片刻，待菌體自然沉降穩(wěn)定后,，先用低倍鏡尋找計(jì)數(shù)室的位置(視野宜調(diào)暗些),，找到后將它移到視野中央，再換高倍鏡觀察和計(jì)數(shù),。計(jì)數(shù)完畢后,，洗凈計(jì)數(shù)板。每個(gè)稀釋度計(jì)數(shù)一次,。

計(jì)數(shù)原則：為了減少誤差,，常取4個(gè)角上的4個(gè)中方格和中央的1個(gè)中方格計(jì)數(shù)，zui后取其平均值,。另外：計(jì)上不計(jì)下,，計(jì)左不計(jì)右，計(jì)數(shù)務(wù)必要有一定路徑,。

根據(jù)OD值與酵母細(xì)胞血球計(jì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。

注意事項(xiàng)

微生物的生長(zhǎng)繁殖是其內(nèi)外各種環(huán)境因素相互作用下生理、代謝等狀態(tài)的綜合反映,，因此,，有關(guān)生長(zhǎng)繁殖的數(shù)據(jù)就可以作為研究多種生理、生化和遺傳等問(wèn)題的重要指標(biāo)；同時(shí),，微生物在生產(chǎn)實(shí)踐上的各種應(yīng)用或人類對(duì)致病,、霉腐等有害微生物的防治，也都與它們的生長(zhǎng)繁殖或抑制緊密相關(guān),。
本實(shí)驗(yàn)方法有其顯著的優(yōu)點(diǎn),，也有一些不足之處：
1. 血球計(jì)數(shù)板是一種常用的微生物直接技術(shù)方法，具有直觀快速,、容易操作等優(yōu)點(diǎn),，但費(fèi)力，傷眼睛,，且對(duì)菌懸液濃度要求高,，一般不宜過(guò)低或過(guò)高(常大于10~6個(gè)/ｍ），OD值應(yīng)在0.1-0.65之間,，不易把握,。而且此法不能測(cè)出活菌數(shù)，若選用臺(tái)酚藍(lán)等染色液,可使死細(xì)胞染為藍(lán)色,活細(xì)胞不被染色,，從而測(cè)出活菌數(shù),。
2. 濕重法和干重法可以體現(xiàn)發(fā)酵液中生物質(zhì)的多少,但不能反映菌絲生理狀態(tài),衰老程度,甚至不能區(qū)分細(xì)胞死活。
3．對(duì)輻射生長(zhǎng)的絲狀真菌進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)速率法衡量其生長(zhǎng)狀況來(lái)的簡(jiǎn)捷,、方便,，但似乎應(yīng)用性不強(qiáng)。
因此,，每種方法都各有優(yōu)點(diǎn)和局限性,，只有在考慮了這些因素同需要著手解決的問(wèn)題之間的關(guān)系以后，才能選擇較優(yōu)者,，或者幾種方法同時(shí)并用,。