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激光掃描共聚焦顯微鏡可測定的樣品種類很多．包括生物材料,、組織(切片),、細(xì)胞(亞細(xì)胞)結(jié)構(gòu)等。樣品中熒光的來源主要有如下幾種：自發(fā)熒光(autofluorescence),、熒光染色,、免疫熒光、熒光蛋白,、誘發(fā)熒光(induced fluorescence)及酶致熒光(enzymatically produced fluorescence)等等,。其中大部分熒光素的激發(fā)和發(fā)射波長均可在儀器自帶軟件的染料信息庫中找到。
1．觀察步驟及儀器操作 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制備樣品完畢后,。即可進(jìn)行觀察,。基本步驟如下：
(1)開啟儀器電源及光源：一般先開啟顯微鏡和激光器,，再啟動(dòng)計(jì)算機(jī),，然后啟動(dòng)操作軟件，設(shè)置熒光樣品的激發(fā)光波長,，選擇相應(yīng)的濾光鏡組塊。以便光電倍增管(photo multiplier tube,，PMT)檢測器能得到足夠的信號(hào)結(jié)果,。使用汞燈的注意事項(xiàng)同普通熒光顯微鏡。
(2)設(shè)置相應(yīng)的掃描方式：在目視模式下．調(diào)整所用物鏡放大倍數(shù),，在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細(xì)胞,。切換到掃描模式，調(diào)整雙孔針和激光強(qiáng)度參數(shù),，即可得到清晰的共聚焦圖像,。
(3)獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后,，保存圖像結(jié)果即可,。
(4)關(guān)閉儀器：儀器測定樣品結(jié)束后，先關(guān)閉激光器部分,，計(jì)算機(jī)仍可繼續(xù)進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)處理,。若要退出整個(gè)激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)．則應(yīng)該在激光器關(guān)閉后，待其冷卻至少10分鐘后再關(guān)閉計(jì)算機(jī)及總開關(guān),。
2．獲取三維圖像 激光掃描共聚焦顯微鏡具有細(xì)胞“CT"功能,，因此,，它可以在不損傷細(xì)胞的情況下，獲得一系列光學(xué)切片圖像,。選用“Z-Stack"模式,，即可實(shí)現(xiàn)此項(xiàng)功能。其基本步驟是：
①開啟“Z-Stack"選項(xiàng),；
②確定光學(xué)切片的位置及層數(shù),；
③啟動(dòng)“Start"，獲得三維圖像,。
3．獲取時(shí)間序列圖像 共聚焦顯微鏡的"Time-Series"功能,，可以自動(dòng)在實(shí)驗(yàn)者規(guī)定的時(shí)間內(nèi)按照設(shè)定的時(shí)間間隔獲取圖像。只需設(shè)定所需的時(shí)間間隔以及所需圖像數(shù)量,，開啟“Start T"功能鍵,，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?！癟ime-Series"功能大大減輕了實(shí)驗(yàn)者的勞動(dòng)強(qiáng)度,，對于熒光漂白恢復(fù)和鈣離子成像等實(shí)驗(yàn)非常實(shí)用。
4．注意事項(xiàng)及維護(hù)保養(yǎng)
(1)儀器周圍要遠(yuǎn)離電磁輻射源,；
(2)環(huán)境無震動(dòng),，無強(qiáng)烈的空氣擾動(dòng)；
(3)室內(nèi)具有遮光系統(tǒng),，保證熒光樣品不會(huì)被外源光漂白,；
(4)環(huán)境清潔；
(5)控制工作溫度在5～25℃,。
