| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一,、材料準(zhǔn)備：
1. 中性甲醛固定液：
甲醛（37%-40%，市售,，本所購(gòu)買即為此濃度）100 mL 磷酸氫二鈉6.5 g 磷酸二氫鉀（鈉）4 g 雙蒸水900 mL
2. 1%鹽酸乙醇液：
鹽酸1份 70%酒精100份
3. 甘油蛋白貼片劑：
蛋白50 ml 甘油50 ml 水楊酸鈉（防腐劑）1 g
4. 配制
（1）將雞蛋一個(gè)打破入碗或杯中,，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調(diào)打成雪花狀泡沫,。
（2）然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中,，經(jīng)數(shù)小時(shí)或一夜，即可濾出透明蛋白液,。
（3）此時(shí)在其中再加等量的甘油,，稍稍振搖使兩者混合。
（4）zui后加入防腐劑（水楊酸鈉）作防腐用,?？杀４鎺讉€(gè)月。
二,、實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 取材
（1）頸椎脫臼法處死小鼠,，打開腹腔，剪取肝組織（或其他組織）,。
（2）切取的組織塊不宜太大,，以利于固定劑穿透，通常以5 mm×5 mm×2 mm或10 mm×10 mm×2 mm 為宜,。
（3）取下所需要的肝組織,，切成一小塊2~3 mm 厚。
2. 固定
（1）將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下
（2）立即投入中性福爾馬林固定液中固定
（3）固定30~50 min,。
3. 洗滌
材料經(jīng)固定后,，流水沖洗,，數(shù)小時(shí)或過。
4. 脫水
（1）材料依次經(jīng)70%,、80%,、90%各級(jí)乙醇溶液脫水，各30 min,。
（2）再放入95%,、100%各2次，每次20 min,。
5. 透明
（1）純酒精,、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ15 min,、Ⅱ15 min（至透明為止）,。
（2）由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟,，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡,。
（3）當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時(shí)，光線可以透過,，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài),。 6. 透蠟
（1）放入二甲苯和石蠟各半的混合液15 min，再放入石蠟Ⅰ,、石蠟Ⅱ透蠟各50~60分鐘,。
（2）透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達(dá)到飽和程度以便包埋,。透蠟時(shí)間根據(jù)組織大小而定,。
（3）透蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，并保持箱內(nèi)溫度在55~60℃左右,，注意溫度不要過高,，以免組織發(fā)脆。一般置于恒溫箱0.5 h,。
7. 包埋
（1）包埋時(shí)，用鑷子夾取石蠟?zāi)Ｗ樱ń饘儋|(zhì)地）在酒精燈上稍加熱,，放在平的桌面上,。
（2）從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少許石蠟,。
（3）再將鑷子在酒精燈上稍加熱,，夾取材料將切面朝下放入蠟?zāi)Ｖ校帕姓R,。
（4）再放上包埋盒,，輕輕倒入熔蠟,。
8. 切片
（1）將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上。
（2）將切片刀固定在刀夾上,，刀口向上,。
（3）搖動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石蠟塊與刀口貼近,，但不可超過刀口,。
（4）調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右,。
（5）調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度,，一般為4~10微米。
（6）一切調(diào)整好后主可以開始切片,。此時(shí)右手搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪,，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起,，搖轉(zhuǎn)速度不可太急,，通常以40~50 r/min。
（7）切成的蠟帶到20~30 cm 長(zhǎng)時(shí),，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起,，以免卷曲，并牽引成帶,，平放在蠟帶盒上,，靠刀面的一面較光滑，朝下,，較皺的一面朝上,。
（8）用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴,，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好,。
（9）切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟,，把切片機(jī)擦拭干凈妥為保存,。
9. 展片、貼片
打開水浴鍋,，使水溫維持在40~45℃,，另準(zhǔn)備30%乙醇溶液。
（1）切片時(shí),，將一碗30%乙醇溶液放于切片機(jī)旁的桌面上,。
（2）用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上,，使切片展開,。
（3）小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開,，用一個(gè)載玻片將切片完整，已展開的切片撈至溫水中,，使之充分展開,。
（4）另取潔凈的載玻片，撈起展開的切片,，使其位于切片1/3處,，另一端（磨邊，粗糙的一端）磨面上標(biāo)記或貼上標(biāo)簽,，放于切片架上,。
10. 脫蠟復(fù)水
（1）將水浴鍋溫度調(diào)至60℃，待水溫控制在60℃時(shí),。
（2）將切片連同切片架放入一干燥的染色缸內(nèi),，放入水浴鍋中，蓋上蓋子（可密封）,，30 min 至蠟熔化,。
（3）之后，石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ,、Ⅱ脫蠟各5 min,，然后放入100%、95%,、90%,、80%、70%各級(jí)酒精溶液中各3~5 min,，再放入蒸餾水中3 min,。
11. 染色
（1）切片放入蘇木精中染色約10~30 min。
（2）染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低,，適當(dāng)縮短或延長(zhǎng),。
（3）室溫高時(shí)促進(jìn)染色，染色時(shí)間可短些,，否則可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間,，冬季室溫低時(shí)可放入恒溫箱中染色。
12. 水洗
（1）用自來(lái)水流水沖洗約15 min,。
（2）使切片顏色變藍(lán)（或放入堿性水中也可）,。
（3）但要注意流水不能過大，以防切片脫落,。
13. 分化
（1）將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色。
（2）約2秒至數(shù)十秒鐘,，見切片變紅,，顏色較淺即可,。
14. 漂洗
切片再放入自來(lái)水流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。
15. 脫水Ⅰ
切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5 min,。
16. 復(fù)染
（1）用0.5%伊紅乙醇液對(duì)比染色1~3 min,。
（2）伊紅主要染細(xì)胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核的濃淡相配合,，如果細(xì)胞核染色較濃,，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對(duì)比,。
（3）反之,，如果細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)淡染,?？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細(xì)胞質(zhì)容易著色,，并且經(jīng)乙醇脫水時(shí)不易褪色,。
17. 脫水Ⅱ
（1）將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色。
（2）然后放入無(wú)水乙醇中3~5 min,。
（3）zui后用吸水紙吸干多余的乙醇,。
18. 透明
（1）切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5 min,。
（2）二甲苯應(yīng)盡量保持無(wú)水,，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無(wú)水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分,。
（3）切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象,，說(shuō)明脫水未盡，應(yīng)退回乙醇中重新脫水,，否則切片難以鏡檢,。
19. 封藏：中性樹膠封存
因切片經(jīng)二甲苯透明，使用中性樹膠作為封藏劑,，樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度,。
20. 封藏的方法：
（1）封片前應(yīng)根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片,。
（2）材料透明后,，在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上）,。
（3）迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬(wàn)不能待二甲苯干燥后再進(jìn)行）,，用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下,，這樣就可以減少或避免產(chǎn)生氣泡,。
（4）如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補(bǔ)足,。
（5）如膠液過多,，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠,。
（6）染色結(jié)果：細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)色,，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。 三,、免疫組化染色
1. 石蠟切片,，步驟同前。切片經(jīng)貼片后,，60℃烤片30 min使蠟熔化,，經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min,，脫蠟,。然后，將切片放入100%,、95%,、90%、80%,、70%乙醇中3~5 min,，再放入蒸餾水中3 min，水化,。
2. 脫蠟和水化后,，用PBS（pH7.4，具體看所用抗體及染色試劑說(shuō)明）沖洗3次,，每次3分鐘,。洗瓶沖洗。
3. 根據(jù)抗體的要求,，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù),。可選步驟,，具體見抗體說(shuō)明書,。
4. 每張切片加1滴或50 μl 3%過氧化氫，室溫下孵育10分鐘,，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性,。PBS沖洗3次，每次3分鐘。此步驟是對(duì)內(nèi)源性過氧化物酶含量高的組織而言,。
5. 除去PBS液,，每張切片加1滴或50 μl 的*抗體,，室溫下孵育60分鐘或4℃過,，具體參見每種抗體的說(shuō)明書。PBS沖洗3次,，每次3分鐘,。
6. 除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl 即用型MaxVisionTM試劑或SP試劑,，室溫下孵育10~15分鐘,。PBS沖洗3次，每次3分鐘,。
7. 除去PBS液,，每張切片加2滴或100 μl新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3~5分鐘（DAB）或37℃環(huán)境下10~30分鐘（AEC）,。
8. 自來(lái)水沖洗,，蘇木素復(fù)染10分鐘，PBS或自來(lái)水沖洗返藍(lán),。如果用DAB顯色,，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明,，步驟同H-E染色,，中性樹膠封固；如果用AEC顯色,，則切片不能經(jīng)酒精脫水,，而直接用水性封片劑封片。
收起 |
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| 注意事項(xiàng) | 一,、取材注意事項(xiàng) 1. 取材動(dòng)作要迅速,，不宜作太久的拖延以免組織細(xì)胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化,。 2. 切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進(jìn)行選擇,，盡可能不要損傷所需要的部分。
二,、固定注意事項(xiàng) 1. 一般固定液,，都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處,，不宜放在日光下,，以免引起化學(xué)變化，失去固定作用。 2. 有些混合固定液的成份之間會(huì)發(fā)生氧化還原作用,，一定要在使用前才混合,，如果混合太早，固定時(shí)就沒有作用了,。 3. 固定材料時(shí),，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍,，有些水分多的材料,，中間應(yīng)更換1~2次新液。 4. 材料固定完畢后,，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里,，同時(shí)在容器外上標(biāo)簽，并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)簽,，以免相互混淆,。標(biāo)簽上注明固定液、材料來(lái)源,、日期等,。標(biāo)簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫,。
三,、脫水注意事項(xiàng) 1. 脫水必須在有蓋的玻璃品中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分,。 2. 在更換高一級(jí)的脫水劑時(shí),，不要移動(dòng)材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑,，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液,，然后于皿中加入高一級(jí)脫水劑。 3. 在低濃度酒精中,，每級(jí)停留不宜太長(zhǎng),，否則易使組織變軟，助長(zhǎng)材料的解體,。 4. 在高濃度或純酒精中,，每級(jí)停留的時(shí)間也不宜太長(zhǎng)，否則會(huì)使組織變脆,，影響切片,。 5. 如需過，應(yīng)停留在70%酒精中,。 6. 脫水必須*,，否則不易透明,，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象。
四,、透明注意事項(xiàng) 1. 使用透明劑時(shí),，要隨時(shí)蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進(jìn)入,。 2. 更換每級(jí)透明劑,，動(dòng)作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸,，另一方面能避免吸收濕氣,。 3. 在透明過程中，如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀,，說(shuō)明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水,，然后再透明,。 五、透蠟注意事項(xiàng) 1. 盡量保持在較低溫度中進(jìn)行,，以石蠟不凝固為度,。 2. 透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低,。 3. 操作要迅速,，力求在zui短的時(shí)間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬,、變脆,、收縮等。 |
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中級(jí)會(huì)員·14年
