聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級會員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機(jī)：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號中華門大廈18樓D座
- 個性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
實(shí)驗(yàn)方法
- 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 選用Wistar大鼠經(jīng)消化酶灌注肝臟后,用分離液分離HSC,，通過觀察其自發(fā)熒光及其顯著特征性結(jié)構(gòu)的脂肪染色,、細(xì)胞免疫化學(xué)染色等方法鑒定,。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 雄性 SD 大鼠 |
| 試劑、試劑盒 | 戊巴比妥鈉 小牛血清 DMEM 酶消化液I,、Ⅱ Nycodenz D-Hanks’液 HBSS 臺盼蘭 |
| 儀器,、耗材 | 手術(shù)器械 尼龍網(wǎng) 相差顯微鏡 熒光顯微鏡 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺上剖腹,，進(jìn)行門靜脈插管,。
2. 以D-Hanks’液灌注，同時剪開下腔靜脈,，沖掉血液后,，改灌以100 ml 酶消化液I(0.05% IV 型膠原酶)。
3. 待肝臟變軟后,，離體肝臟并剪碎，繼續(xù)以酶消化液II(含20U/ml DNase I 的0.05% IV 型膠原酶)消化15 min,，尼龍網(wǎng)過濾后以450 g 離心5 min(4℃,，下同)。
4. 以HBSS 重懸沉淀至10 ml,，再混以20 ml Nycodenz 液,，分置于離心管中，并分別覆以2-3 ml HBSS,，1450 g 離心16 min 后取界面細(xì)胞,。
5. 以HBSS重懸后再次離心收集細(xì)胞，以DMEM重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),，并判斷存活率和產(chǎn)量,，zui后按照常規(guī)方法接種(105 細(xì)胞/cm2 )，次日換液,，以后每2-3 天換液一次,。
6. 傳代方法：棄去培液后以D-Hanks’液洗兩次，加0.125%胰酶(原代加0.05% EDTA)消化,，鏡下觀察細(xì)胞突起回縮(2-5 min左右),，以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(yīng)(若不用EDTA,，可以不需離心)， 充分吹打后以 1:2-1:3 接種,，然后繼續(xù)培養(yǎng)(5% CO2,，37℃)。
接種次日,，光鏡下可見細(xì)胞呈星芒狀，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴,，熒光鏡下328 nm 處見自發(fā)熒光,。附照片(圖 1)。
圖 1. 原代培養(yǎng)第 2 天的大鼠肝星狀細(xì)胞 收起 |
| 其他 | 一,、討論 進(jìn)一步鑒別需要做免疫組化：Desmin 和α-SMA,；后者在細(xì)胞激活后才表達(dá)。也采用過無須原位消化的方案,，*可行,，只不過消化時間更難控制！實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)的或傳代后9代內(nèi)的細(xì)胞(5 代以內(nèi)),。 二,、文獻(xiàn) 1. 袁桃霞，張錦生,，張?jiān)露?，? 大鼠肝 Ito 細(xì)胞的體外培養(yǎng)及肝素對其抑制作用的觀察. 上海醫(yī)科大學(xué) 學(xué)報(bào),1996,23(2):90-93.
|
