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實驗方法
- 細胞培養(yǎng)技術
| 實驗方法原理 | 選用Wistar大鼠經消化酶灌注肝臟后,用分離液分離HSC,，通過觀察其自發(fā)熒光及其顯著特征性結構的脂肪染色,、細胞免疫化學染色等方法鑒定,。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 雄性 SD 大鼠 |
| 試劑,、試劑盒 | 戊巴比妥鈉 小牛血清 DMEM 酶消化液I,、Ⅱ Nycodenz D-Hanks’液 HBSS 臺盼蘭 |
| 儀器,、耗材 | 手術器械 尼龍網 相差顯微鏡 熒光顯微鏡 |
| 實驗步驟 | 一,、實驗步驟 1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺上剖腹，進行門靜脈插管,。
2. 以D-Hanks’液灌注,，同時剪開下腔靜脈，沖掉血液后,，改灌以100 ml 酶消化液I(0.05% IV 型膠原酶),。
3. 待肝臟變軟后，離體肝臟并剪碎,，繼續(xù)以酶消化液II(含20U/ml DNase I 的0.05% IV 型膠原酶)消化15 min，尼龍網過濾后以450 g 離心5 min(4℃,，下同),。
4. 以HBSS 重懸沉淀至10 ml,，再混以20 ml Nycodenz 液，分置于離心管中,，并分別覆以2-3 ml HBSS,，1450 g 離心16 min 后取界面細胞。
5. 以HBSS重懸后再次離心收集細胞,，以DMEM重懸后進行細胞計數(shù),，并判斷存活率和產量，zui后按照常規(guī)方法接種(105 細胞/cm2 ),，次日換液,，以后每2-3 天換液一次。
6. 傳代方法：棄去培液后以D-Hanks’液洗兩次,，加0.125%胰酶(原代加0.05% EDTA)消化,，鏡下觀察細胞突起回縮(2-5 min左右)，以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(若不用EDTA,，可以不需離心),， 充分吹打后以 1:2-1:3 接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)(5% CO2,，37℃),。
接種次日,，光鏡下可見細胞呈星芒狀,，胞質內有脂滴，熒光鏡下328 nm 處見自發(fā)熒光,。附照片(圖 1),。
圖 1. 原代培養(yǎng)第 2 天的大鼠肝星狀細胞 收起 |
| 其他 | 一、討論 進一步鑒別需要做免疫組化：Desmin 和α-SMA,；后者在細胞激活后才表達,。也采用過無須原位消化的方案，*可行,，只不過消化時間更難控制,！實驗采用原代培養(yǎng)的或傳代后9代內的細胞(5 代以內)。 二,、文獻 1. 袁桃霞,，張錦生，張月娥,，等. 大鼠肝 Ito 細胞的體外培養(yǎng)及肝素對其抑制作用的觀察. 上海醫(yī)科大學 學報,1996,23(2):90-93.
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