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Wistar大鼠乳鼠

FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精

眼科剪 滴管 離心機(jī) 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱

1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠,，經(jīng)75%酒精消毒，斷頭處死,。

2. 取腦放入冷的D-Hanks’平衡鹽溶液,，去除腦膜及大血管。

3. 分離兩側(cè)大腦皮質(zhì)并剪成1mm³ 大小,，加入0.25%胰蛋白酶37℃空氣浴震蕩消化10 min,。

4. 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心(1 000 rpm,，10 min),，去上清。

5. 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀,，經(jīng)75 µm 篩網(wǎng)過(guò)濾,，收集濾液，再次離心10 min,，收集沉淀用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1.5×10⁶/ml,，種植于75 cm² 培養(yǎng)瓶,。

6. 經(jīng)1 小時(shí)差速黏附去除成纖維細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一新的75 cm² 培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng),，兩天換液一次,。

7. 7 天后將培養(yǎng)瓶放入水平搖床(260 rpm，2 h,，37℃),，換液棄除小膠質(zhì)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱平衡1 小時(shí)，重新置于水平搖床18 h,。

8. 換液棄除少突膠質(zhì)細(xì)胞,，用新鮮培養(yǎng)基洗2 遍，加入0.25%胰蛋白酶與0.02% EDTA 1:1 混合液消化,、傳代備用,。

二、 形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況,。

三,、 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)繪制

傳代后的細(xì)胞以 2×10⁴/ml 的密度種植于24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，3 天換液1 次,， 每24 小時(shí)取3 孔計(jì)數(shù),，連續(xù)7 天，取均值繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn),。

四,、星型膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細(xì)胞組織化學(xué)鑒定方法。取星型膠質(zhì)細(xì)胞去除培養(yǎng)基,，用PBS洗3 遍,，4%多聚甲醛室溫固定1 小時(shí)，PBS洗3 次,，每次5 分鐘,，0.3% H₂O₂ 30 分鐘以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物，PBS洗3 次每次5 分鐘,，加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封閉30 分鐘,，滴加兔抗GFAP 抗體(1:75)，4℃ 18 小時(shí),，PBS洗3 次每次5 分鐘,，滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫20 分鐘,，PBS洗3 次,，每次5 分鐘，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,，室溫20 分鐘,，PBS洗3 次，每次5 分鐘,，DAB顯色,。

1. 形態(tài)學(xué)觀察：光鏡下,，傳代的星型膠質(zhì)細(xì)胞折光性強(qiáng),，形狀不規(guī)則,，主要為多角形，胞體大而扁平,、胞質(zhì)豐富,，細(xì)胞核圓形或卵圓形，偏于胞體一側(cè),，內(nèi)有1-2 個(gè)核仁,，有多個(gè)粗短枝狀初級(jí)胞突，部分細(xì)胞突起變細(xì)變長(zhǎng),，6-7 天后細(xì)胞融合成單層,，符合神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)特性，如下圖,。
 

星型膠質(zhì)細(xì)胞單層生長(zhǎng)(×100)

2.  鑒定：細(xì)胞經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均為細(xì)胞漿著色，而胞核未見(jiàn)著色,，見(jiàn)下圖,，證明采用上述方法獲得的細(xì)胞為星型膠質(zhì)細(xì)胞，純度高,， 可用于實(shí)驗(yàn),。

圖2：免疫組化鑒定，GFAP 染色

3. 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)繪制如下：

圖3：細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

SD大鼠

苯巴比妥 解剖液 胰蛋白酶 Dnase DM培養(yǎng)液

離心管 培養(yǎng)箱 手術(shù)器材

一、 取14.5d SD大鼠一只,。

二,、 苯巴比妥0.5 ml 腹腔注射，待麻醉后置于手術(shù)臺(tái)上,，酒精棉球消毒皮膚,，開(kāi)腹取出子宮（約12-14個(gè)），放入解剖液中,，剖開(kāi)子宮,，取出胚胎，放入解剖液中,，在耳眼之間離斷,，取頭側(cè)部組織，去除腦膜組織,，取原始中腦區(qū)組織，放入離心管裝的解剖液中,，待全部取出后,，1500轉(zhuǎn)2分鐘,。

三、 用吸管吸出上清液,，在組織細(xì)胞沉淀中加入胰蛋白酶一管（1 ml/vial）,，室溫30分鐘，1500轉(zhuǎn),，離心5分鐘（離心前可加入解剖液以終止胰酶作用）,。

四、吸去上清,，在組織細(xì)胞沉淀中加入Dnase 一管（2 ml/vial）,，37℃反應(yīng)10分鐘，1500轉(zhuǎn),，離心5分鐘,，吸去上清，在組織細(xì)胞沉淀中加入2 ml DM培養(yǎng)液吹打,，計(jì)數(shù)（計(jì)數(shù)公式為（N1+N2+N3+N4）/4*10 _⁴）,，以3*10⁵個(gè)/瓶在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，做好標(biāo)記（時(shí)間,、原代還是第幾代傳代,，姓名，細(xì)胞名稱(chēng)等）,，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

1.  麻醉藥劑量應(yīng)梢大于普通用量。

2.   一定要仔細(xì)剔除干凈腦膜組織,，否則會(huì)極大地影響培養(yǎng)細(xì)胞的純度,。

3.  細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不同于分子生物學(xué)，由于離心速度較慢,，離心組織和細(xì)胞貼壁不如核酸緊密,，取出離心后的上清液時(shí)一定要用吸管吸取，禁止用傾倒的方法,。

4.  為保護(hù)胚胎,，胚胎操作應(yīng)在放置冰塊的托盤(pán)中進(jìn)行，保持低溫,。

5.  取中腦組織時(shí)應(yīng)先用兩把鑷子夾住所取區(qū)域,，然后用刀片切開(kāi)。

6.  胰酶在細(xì)胞離心時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性,，所以胰酶離心前可加入一定的解剖液稀釋,。

7.  細(xì)胞離心時(shí)在冰凍離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行，以保持細(xì)胞活力,。

8.  吹打細(xì)胞前用火燒吸管頭,，發(fā)紅時(shí)逐漸后退,，使吸管尖變鈍，減少吹打過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的損害,，實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)吹打時(shí)有一定的阻力,。

9.  鼠胚胎較多時(shí)可分批消化，否則體外時(shí)間較長(zhǎng),，細(xì)胞存活率低,。

10.  用Neurobasal medium + B27。

11.   胰酶消化時(shí)加入EDTA可增強(qiáng)消化效果,。

12.  關(guān)鍵在于取材的準(zhǔn)確和原代細(xì)胞的狀態(tài),。

大鼠胚胎

L-15培養(yǎng)基 膠原酶 Dnase D-MEM-BS FCS-DMEM 阿糖胞苷

離心機(jī) 水浴鍋 培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)箱

一,、分離大鼠胚胎（16-18周）新皮層，置于L-15（或Hank’s平衡鹽/DMEM溶液,，無(wú)Hepes）培養(yǎng)基中,，除去腦膜和血管、海馬,、尾核和其他非皮層組織,。

二、 用解剖刀將其切成1 mm³大小的組織塊,。

三,、用1ml槍頭轉(zhuǎn)移250 μl膠原酶儲(chǔ)存液（1.33%，溶于L-15中）到1ml的L-15（或D-MEM）中,。每2只鼠腦組織塊使用1-1.5 ml稀釋膠原酶液,。

四、37℃水浴中孵育30 min,。

五,、1 000 rpm(大約230g)中離心5 min，或3 000 rpm(大約2 000 g)中離心1 min,。

六,、去上清。

七,、在含EDTA-CMF的溶液中重懸細(xì)胞,，并與胰蛋白酶以1：4～1：10比例混合?？梢愿鶕?jù)觀察到的細(xì)胞消化的情況,，適當(dāng)調(diào)整兩者的比例。

八,、加入胰蛋白酶的抑制劑和DNase溶液,，混合5分鐘,。

九、1 000 rpm(大約230 g)中離心5 min,，或3 000 rpm(大約2 000 g)中離心1 min。

十,、去上清,。加入500 μl D-MEM-BS。

十一,、輕輕吹打成單細(xì)胞懸液,，開(kāi)始用5 ml槍頭吹打10次，在需要時(shí)用18-gauge的針頭吹打,。( 注意：不要產(chǎn)生氣泡,。）200目/300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾。

十二,、將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含10%FCS-DMEM的培養(yǎng)瓶中,，培養(yǎng)密度為2X10⁶/25 cm²培養(yǎng)瓶，4～6 X10⁶/75 cm³培養(yǎng)瓶,。在37.2℃,，37.5%中培養(yǎng)。

十三,、第2天換液,，以后每隔3天換液。

十四,、7-10天,，細(xì)胞發(fā)生融合。

十五,、細(xì)胞融合后,，將瓶蓋用封口膜密封好，在軌跡搖床上培養(yǎng),，旋轉(zhuǎn)速度以不產(chǎn)生氣泡為宜,。37℃振搖過(guò)。細(xì)胞注意避光,。

十六,、去上清，加入新鮮10%FCS-DMEM,。

十七,、加入200 μl 1 mM的阿糖胞苷/10 ml培養(yǎng)基。在37.2℃,，37.5%中培養(yǎng)孵育48小時(shí)以消除分裂的細(xì)胞,。

十八,、換用新鮮10%FCS-DMEM，孵育恢復(fù)24小時(shí),。

十九,、重復(fù)17-18步驟，消除所有的分裂細(xì)胞