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Wistar大鼠乳鼠

FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精

眼科剪 滴管 離心機 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱

1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠，經(jīng)75%酒精消毒,，斷頭處死,。

2. 取腦放入冷的D-Hanks’平衡鹽溶液，去除腦膜及大血管,。

3. 分離兩側(cè)大腦皮質(zhì)并剪成1mm³ 大小,，加入0.25%胰蛋白酶37℃空氣浴震蕩消化10 min。

4. 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化,，離心(1 000 rpm,，10 min)，去上清,。

5. 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀,，經(jīng)75 µm 篩網(wǎng)過濾，收集濾液,，再次離心10 min,，收集沉淀用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度至1.5×10⁶/ml,，種植于75 cm² 培養(yǎng)瓶,。

6. 經(jīng)1 小時差速黏附去除成纖維細胞后，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到一新的75 cm² 培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng),，兩天換液一次,。

7. 7 天后將培養(yǎng)瓶放入水平搖床(260 rpm，2 h,，37℃),，換液棄除小膠質(zhì)細胞，放入培養(yǎng)箱平衡1 小時,，重新置于水平搖床18 h,。

8. 換液棄除少突膠質(zhì)細胞，用新鮮培養(yǎng)基洗2 遍,，加入0.25%胰蛋白酶與0.02% EDTA 1:1 混合液消化,、傳代備用,。

二、 形態(tài)學觀察

倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀況,。

三、 細胞生長曲線繪制

傳代后的細胞以 2×10⁴/ml 的密度種植于24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),，3 天換液1 次,， 每24 小時取3 孔計數(shù)，連續(xù)7 天,，取均值繪制生長曲線,。

四、星型膠質(zhì)細胞的鑒定

膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞組織化學鑒定方法,。取星型膠質(zhì)細胞去除培養(yǎng)基,，用PBS洗3 遍，4%多聚甲醛室溫固定1 小時,，PBS洗3 次,，每次5 分鐘，0.3% H₂O₂ 30 分鐘以去除內(nèi)源性過氧化物,，PBS洗3 次每次5 分鐘,，加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封閉30 分鐘，滴加兔抗GFAP 抗體(1:75),，4℃ 18 小時,，PBS洗3 次每次5 分鐘，滴加生物素標記羊抗兔IgG,，室溫20 分鐘,，PBS洗3 次，每次5 分鐘,，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,，室溫20 分鐘，PBS洗3 次,，每次5 分鐘,，DAB顯色。

1. 形態(tài)學觀察：光鏡下,，傳代的星型膠質(zhì)細胞折光性強，形狀不規(guī)則,，主要為多角形,，胞體大而扁平、胞質(zhì)豐富,，細胞核圓形或卵圓形,，偏于胞體一側(cè),，內(nèi)有1-2 個核仁，有多個粗短枝狀初級胞突,，部分細胞突起變細變長,，6-7 天后細胞融合成單層，符合神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長特性,，如下圖,。
 

星型膠質(zhì)細胞單層生長(×100)

2.  鑒定：細胞經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均為細胞漿著色,，而胞核未見著色,，見下圖，證明采用上述方法獲得的細胞為星型膠質(zhì)細胞,，純度高,， 可用于實驗。

圖2：免疫組化鑒定,，GFAP 染色

3. 細胞生長曲線繪制如下：

圖3：細胞生長曲線

SD大鼠

苯巴比妥 解剖液 胰蛋白酶 Dnase DM培養(yǎng)液

離心管 培養(yǎng)箱 手術器材

一,、 取14.5d SD大鼠一只,。

二、 苯巴比妥0.5 ml 腹腔注射,，待麻醉后置于手術臺上,，酒精棉球消毒皮膚，開腹取出子宮（約12-14個）,，放入解剖液中,，剖開子宮，取出胚胎,，放入解剖液中,，在耳眼之間離斷，取頭側(cè)部組織,，去除腦膜組織,，取原始中腦區(qū)組織，放入離心管裝的解剖液中,，待全部取出后,，1500轉(zhuǎn)2分鐘。

三,、 用吸管吸出上清液,，在組織細胞沉淀中加入胰蛋白酶一管（1 ml/vial），室溫30分鐘，1500轉(zhuǎn),，離心5分鐘（離心前可加入解剖液以終止胰酶作用）,。

四、吸去上清,，在組織細胞沉淀中加入Dnase 一管（2 ml/vial）,，37℃反應10分鐘，1500轉(zhuǎn),，離心5分鐘,，吸去上清，在組織細胞沉淀中加入2 ml DM培養(yǎng)液吹打,，計數(shù)（計數(shù)公式為（N1+N2+N3+N4）/4*10 _⁴），以3*10⁵個/瓶在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),，做好標記（時間,、原代還是第幾代傳代，姓名,，細胞名稱等）,，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.  麻醉藥劑量應梢大于普通用量,。

2.   一定要仔細剔除干凈腦膜組織,，否則會極大地影響培養(yǎng)細胞的純度。

3.  細胞培養(yǎng)技術不同于分子生物學,，由于離心速度較慢,，離心組織和細胞貼壁不如核酸緊密，取出離心后的上清液時一定要用吸管吸取,，禁止用傾倒的方法,。

4.  為保護胚胎，胚胎操作應在放置冰塊的托盤中進行,，保持低溫,。

5.  取中腦組織時應先用兩把鑷子夾住所取區(qū)域，然后用刀片切開,。

6.  胰酶在細胞離心時會對細胞產(chǎn)生毒性,，所以胰酶離心前可加入一定的解剖液稀釋。

7.  細胞離心時在冰凍離心機內(nèi)進行,，以保持細胞活力,。

8.  吹打細胞前用火燒吸管頭，發(fā)紅時逐漸后退,，使吸管尖變鈍,，減少吹打過程中對細胞的損害，實驗中也發(fā)現(xiàn)吹打時有一定的阻力。

9.  鼠胚胎較多時可分批消化,，否則體外時間較長,，細胞存活率低。

10.  用Neurobasal medium + B27,。

11.   胰酶消化時加入EDTA可增強消化效果,。

12.  關鍵在于取材的準確和原代細胞的狀態(tài)。

大鼠胚胎

L-15培養(yǎng)基 膠原酶 Dnase D-MEM-BS FCS-DMEM 阿糖胞苷

離心機 水浴鍋 培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)箱

一、分離大鼠胚胎（16-18周）新皮層,，置于L-15（或Hank’s平衡鹽/DMEM溶液,，無Hepes）培養(yǎng)基中，除去腦膜和血管,、海馬,、尾核和其他非皮層組織。

二,、 用解剖刀將其切成1 mm³大小的組織塊,。

三、用1ml槍頭轉(zhuǎn)移250 μl膠原酶儲存液（1.33%,，溶于L-15中）到1ml的L-15（或D-MEM）中,。每2只鼠腦組織塊使用1-1.5 ml稀釋膠原酶液。

四,、37℃水浴中孵育30 min,。

五、1 000 rpm(大約230g)中離心5 min,，或3 000 rpm(大約2 000 g)中離心1 min,。

六、去上清,。

七,、在含EDTA-CMF的溶液中重懸細胞，并與胰蛋白酶以1：4～1：10比例混合,?？梢愿鶕?jù)觀察到的細胞消化的情況，適當調(diào)整兩者的比例,。

八,、加入胰蛋白酶的抑制劑和DNase溶液，混合5分鐘,。

九,、1 000 rpm(大約230 g)中離心5 min,，或3 000 rpm(大約2 000 g)中離心1 min。

十,、去上清,。加入500 μl D-MEM-BS。

十一,、輕輕吹打成單細胞懸液,，開始用5 ml槍頭吹打10次，在需要時用18-gauge的針頭吹打,。( 注意：不要產(chǎn)生氣泡,。）200目/300目尼龍網(wǎng)過濾。

十二,、將細胞轉(zhuǎn)移到含10%FCS-DMEM的培養(yǎng)瓶中,，培養(yǎng)密度為2X10⁶/25 cm²培養(yǎng)瓶，4～6 X10⁶/75 cm³培養(yǎng)瓶,。在37.2℃,，37.5%中培養(yǎng)。

十三,、第2天換液，以后每隔3天換液,。

十四,、7-10天，細胞發(fā)生融合,。

十五,、細胞融合后，將瓶蓋用封口膜密封好,，在軌跡搖床上培養(yǎng),，旋轉(zhuǎn)速度以不產(chǎn)生氣泡為宜。37℃振搖過,。細胞注意避光,。

十六、去上清,，加入新鮮10%FCS-DMEM,。

十七、加入200 μl 1 mM的阿糖胞苷/10 ml培養(yǎng)基,。在37.2℃,，37.5%中培養(yǎng)孵育48小時以消除分裂的細胞。

十八,、換用新鮮10%FCS-DMEM,，孵育恢復24小時。

十九、重復17-18步驟,，消除所有的分裂細胞