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標簽： 大鼠 大腦皮層 神經(jīng)元
大鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞培養(yǎng)可以：（1）獲得大鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞,；（2）用于神經(jīng)元細胞定向分化研究,；（3）用于神經(jīng)元細胞凋亡研究。
實驗方法
- 機械性劃割培養(yǎng)
- 酶消化法
| 實驗方法原理 | SD胎鼠腦皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)7 d,，微量移液器塑料滴頭于培養(yǎng)孔內(nèi)機械性劃割培養(yǎng)之神經(jīng)元,，依劃割程度不同分為輕、中,、重3組,，對照組除不進行機械性劃割，其余處理同損傷組,，傷后不同時間點（10,，30min ， 1,，3,，6，12,，24 h）檢測細胞存活率及培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(LDH)含量,。 |
|---|---|
| 實驗材料 | SD大鼠 |
| 試劑、試劑盒 | 硼酸硼砂緩沖液 胰酶-EDTA 消化液 D-Hanks’ |
| 儀器,、耗材 | 眼科剪 滴管 離心機 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱 |
| 實驗步驟 | 一,、實驗步驟
1. 孕16 d SD 大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后,，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮膚,，依次剪開皮膚,、肌肉、皮下筋膜,，無菌操作下取出胚胎放入預冷的 D-Hanks’平衡鹽液中,。
2. 在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜,，剪碎組織成約1mm3 大小,，加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱內(nèi)消化20 min，中間搖晃一次,。
3. 隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預冷的培養(yǎng)液(DMEM＋10%FBS)的離心管內(nèi)終止消化液作用5 min,。
4. 用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預冷的 DMEM＋10%FBS 的離心管內(nèi)，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次,，靜置后取上清吸到另一支離心管內(nèi),。重復上述步驟 2～3 次。
5. 將所收集的上清經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾,。
6. 過濾后的細胞懸液于800 rpm 離心5 min,，棄上清，管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液(DMEM＋20%FBS)并吹打 成單細胞懸液,。
7. 細胞計數(shù),，調(diào)整細胞密度按1.5×105/cm2 種入6 孔板內(nèi)，放入CO2 孵箱中培養(yǎng),。培養(yǎng)48 h 后換液并 加入Ara-C使其終濃度為 1×10-5 mM/L,。Ara-C作用24 h 后全量換液。以后每隔 3 天半量換液一次,。 收起 |
| 注意事項 | 1. 上面的步驟是傳統(tǒng)方法,。有許多地方可以進行改動：如消化時可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右，也可用 DNA 酶進行消化,，有人還直接進行吹打,，都可行。
2. 上面雖然時大鼠皮層神經(jīng)元,，但是同樣適用于小鼠,，但是應(yīng)該選擇孕13 d 左右的小鼠。
3. 神經(jīng)元是一種比較難培養(yǎng)的細胞,，因此在接種時細胞的密度一定要夠,。
4. 在玻片上培養(yǎng)神經(jīng)元時，一定要注意玻片的來源和處理方法，這個非常重要,，對神經(jīng)細胞的影響 是很大的,。如果您現(xiàn)在在玻片上培養(yǎng)的神經(jīng)元生長情況還不錯的話，那么您在以后的培養(yǎng)中還是用同 一來源(廠家)的玻片,。
5. 如果有B27 和neurobasal 培養(yǎng)基,，那么就方便了(不用加 AraC):
(1)把細胞懸液用(DMEM＋20%FBS)懸浮，種到培養(yǎng)皿上6－12 h 后,，全量換成 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基,，繼續(xù)培養(yǎng)，3 d 半量換液,。
(2)把細胞懸液用直接用 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基懸浮接種,。
(3)可以用新生1 d 內(nèi)的胎鼠皮層直接培養(yǎng)。
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