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體外培養(yǎng)細(xì)胞 生長,、分裂繁殖的能力,，可用分裂指數(shù)來表示。它與生長曲線有一定的,，如隨著分裂指數(shù)的不斷提高,，細(xì)胞也就進(jìn)入了指數(shù)生長期,。

分裂指數(shù)指細(xì)胞 群體中分裂細(xì)胞 所占的百分比，它是測定細(xì)胞 周期的一個重要指標(biāo),，也是不同實驗研究選擇細(xì)胞的重要依據(jù),。

細(xì)胞

胰酶 甲醇 培養(yǎng)液 冰醋酸 Giemsa染液

CO2培養(yǎng)箱 普通顯微鏡 培養(yǎng)皿 蓋玻片 吸管

一,、消化細(xì)胞 ，將細(xì)胞 懸液接至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中,。

二,、CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，使細(xì)胞長在蓋片上,。

三,、取出蓋片，按下列順序操作：

PBS漂洗3分鐘→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分鐘→Giemsa液染色10分鐘→自來水沖洗,。

四,、蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢,。

五,、計算

分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞 數(shù)/總細(xì)胞 數(shù)×100%

1.  操作時動作要輕，以免使蓋片上的細(xì)胞脫落,。

一、Giemsa染液配制

稱Giemsa粉末0.5 g,，加幾滴甘油研磨,，再加入甘油（使加入的甘油總量為33 ml）。56℃中保溫90-120分鐘,。加入33 ml甲醇,，置棕色瓶中保存，此為Giemsa原液,。使用時按要求用PBS稀釋,。一般稀釋10倍。

細(xì)胞周期指細(xì)胞一個世代所經(jīng)歷的時間,。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期,。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。

單個細(xì)胞的周期測定可采用縮時攝影的方法,，但它不能代表細(xì)胞群體的周期,，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后,，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料,，經(jīng)過兩個細(xì)胞周期后,，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染,。如經(jīng)歷了三個周期,，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺,。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個周期,，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例,，就可算出細(xì)胞周期的值,。

細(xì)胞

BrdU 甲醇 冰醋酸 Giemsa染液 秋水仙素 SSC 檸檬酸三鈉 NaCl

冰箱 玻片 水浴鍋 鍋蓋 紫外燈 光學(xué)顯微鏡

一,、試劑配制

1.  BrdU配制

BrdU 10 mg加雙蒸水10 ml ，4℃下避光保存,。

2.  2×SSC配制

NaCl 1.75 g,，檸檬酸三鈉0.88 g，加水至100 ml,，4℃保存,。

二、細(xì)胞生長至指數(shù)期時,，向培養(yǎng)液中加入BrdU,，使zui終濃度為10 μg/ml。

三,、44小時加秋水仙素,，使每ml中含0.1 μg。

四,、48小時后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中,，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。

五,、常規(guī)染色體制片,。

六、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,，鋪上2×SSC 液,，距紫外燈管6 cm處紫外照射30分鐘。

七,、棄去2×SSC液,，流水沖洗。

八、Giemsa液染色10分鐘,，流水沖洗,，晾干。

九,、鏡檢100個分裂相,，計*、二,、三,、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。

十,、計算

細(xì)胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時）

一,、細(xì)胞周期介紹

細(xì)胞周期（cell cycle)是指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，分為間期與分裂期兩個階段 ,。

1.  間期

間期又分為三期,、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）,。

（1）G1期　　

此期長短因細(xì)胞而異,。體內(nèi)大部分細(xì)胞在完成上一次分裂后，分化并執(zhí)行各自功能,，此G1期的早期階段特稱G0期,。在G1期的晚期階段，細(xì)胞開始為下一次分裂合成DNA所需的前體物質(zhì),、能量和酶類等,。

（2）S期　　

S期是細(xì)胞周期的關(guān)鍵時刻，DNA經(jīng)過復(fù)制而含量增加一倍,，使體細(xì)胞成為4倍體,，每條染色質(zhì)絲都轉(zhuǎn)變?yōu)橛芍z點相連接的兩條染色質(zhì)絲。與此同時,，還合成組蛋白，進(jìn)行中心粒復(fù)制,。S期一般需幾個小時,。

（3）G2期　　

為分裂期做zui后準(zhǔn)備。中心粒已復(fù)制完畢,，形成兩個中心體,，還合成RNA和微管蛋白等。G2期比較恒定,，需用1～1.5小時,。

2.  分裂期

細(xì)胞的有絲分裂（mitosis）需經(jīng)前、中,、后,，末期,，是一個連續(xù)變化過程，由一個母細(xì)胞分裂成為兩個子細(xì)胞,。一般需1～2小時,。

（1）.前期（prophase）染色質(zhì)絲高度螺旋化，逐漸形成染色體（chromosome）,。染色體短而粗,，強嗜堿性。兩個中心體向相反方向移動,，在細(xì)胞中形成兩極,；而后以中心粒隨體為起始點開始合成微管，形成紡錘體,。隨著核仁相隨染色質(zhì)的螺旋化,，核仁逐漸消失。核被膜開始瓦解為離散的囊泡狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng),。

（2）中期（metaphase）細(xì)胞變?yōu)榍蛐?，核仁與核被膜已*消失。染色體均移到細(xì)胞的赤道平面,，從紡錘體兩極發(fā)出的微管附著于每一個染色體的著絲點上,。從中期細(xì)胞可分離得到完整的染色體群，共46個,其中44個為常染色體,2個為性染色體,。男性的染色體組型為46,，XY，女性為46,XX,。分離的染色體呈短粗棒狀或發(fā)夾狀,，均由兩個染色單體借狹窄的著絲點連接構(gòu)成。

（3）后期（anaphase）由于紡錘體微管的活動,，著絲點縱裂,，每一染色體的兩個染色單體分開，并向相反方向移動,，接近各自的中心體,，染色單體遂分為兩組。與此同時,，細(xì)胞波拉長,，并由于赤道部細(xì)胞膜下方環(huán)行微絲束的活動，該部縮窄,，細(xì)胞遂呈啞鈴形,。

（4）末期（ophase）染色單體逐漸解螺旋，重新出現(xiàn)染色質(zhì)絲與核仁；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡組合為核被膜,；組胞赤道部縮窄加深,，zui后*分裂為兩個2倍體的子細(xì)胞。

在體內(nèi)根據(jù)細(xì)胞的分裂能力可把它們分為三類：

①增殖細(xì)胞群,，如造血干細(xì)胞,，表皮與胃腸粘膜上皮的干細(xì)胞。這類細(xì)胞始終保持活躍的分裂能力,，連續(xù)進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán),。

②不再增殖細(xì)胞群，如成熟的紅細(xì)胞,、神經(jīng)細(xì)胞,、心肌細(xì)胞等高度分化的細(xì)胞，它們喪失了分裂能力,，又稱終末細(xì)胞（end cell）,。

③暫不增殖細(xì)胞群，如肝細(xì)胞,、腎小管上皮細(xì)胞,、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞。它們是分化的,，并執(zhí)行特定功能的細(xì)胞,，在通常情況下處于G0期，故又稱G0期細(xì)胞,。在某種刺激下,，這些細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。如肝部分切除術(shù)后,，剩余的肝細(xì)胞迅速分裂,。

流式細(xì)胞儀的工作原理是將待測細(xì)胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進(jìn)入充滿鞘液的流動室,。在鞘液的約束下細(xì)胞排成單列由流動室的噴嘴噴出,，形成細(xì)胞柱。通過對流動液體中排列成單列的細(xì)胞進(jìn)行逐個檢測,，得到該細(xì)胞的光散射和熒光指標(biāo),，分析出其體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu),、DNA、RNA,、蛋白質(zhì),、抗原等物理及化學(xué)特征。

細(xì)胞內(nèi)的DNA含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C,，而G2期的DNA含量是4C,。利用PI標(biāo)記的方法，通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞內(nèi)DNA的相對含量進(jìn)行測定,，可分析細(xì)胞周期各時相的百分比,。

HeLa細(xì)胞

乙醇 RNase-A PI PBS

流式細(xì)胞儀 細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備 離心機 水浴 冰箱 注射器 離心管 封口膜 微量移液器

一,、取對數(shù)生長期細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液,，胰酶適度消化細(xì)胞,，用培養(yǎng)液吹打，800 rpm,，離心 15 min去上清,。

二、PBS洗2次,，加0.5 mL PBS吹勻,，務(wù)必吹散。

三,、用5 mL注射器將細(xì)胞吸起,，用力打入5 mL 70%(預(yù)冷)乙醇中，封口膜封口,。4℃固定夜（可長至2周）,。

四、800 rpm 15 min收集固定細(xì)胞,，PBS洗2次,。

五、用0.4 mL PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)至Tube中輕輕吹打（防止細(xì)胞破碎）,。

六,、加RNase-A約3 μL至終濃度約為50 μg/mL ，37℃水浴消化30 min,；

七,、加PI約50 μL至終濃度約為65 μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min,。

八,、用300目（孔徑40~50微米）尼龍網(wǎng)過濾，上機檢測,。

九,、樣品分析測定及打印,。

一、常見問題

1.  Q：要做胃粘膜組織的DNA含量及倍體檢查,，但取材后要等幾個星期才會做流式細(xì)胞術(shù)檢查,，請問：胃組織要怎樣保存好呢？用低溫保存,，還是用乙醇固定,？或者固定后再低溫下保存？

A：我做過乳腺細(xì)胞的DNA含量測定,，取得組織以后,，先處理成單細(xì)胞懸液，然后再加70%冰乙醇固定,，要保證冰乙醇的zui終濃度為50%,，這樣固定的細(xì)胞懸液可以至少保存12小時，zui多可保存一個月,，上機檢測前再加PI綜合染液,。我就是這樣做的，保存了將近三個星期,，結(jié)果還可以,，變異系數(shù)為5%.

2.  實驗中想用PI分析細(xì)胞周期及凋亡率，請教幾個問題：

Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢,？用PBS配嗎,？

A：RNaseA用PBS配制沒有問題，但是注意要沸水浴去除DNase的活性,。

Q：（2）測細(xì)胞周期和凋亡率時都要用RNAs酶,，可以一起檢測嗎？

A：用流式細(xì)胞儀測定時細(xì)胞周期和凋亡率是同時測定的,，不用擔(dān)心,。

Q：（3）Triton－x－100是固定劑吧，用了70％的冷乙醇（是4℃嗎,？）,，是不是就不用Triton－x－100固定了？

A：Triton X-100是起透化作用的,，不是固定劑,，可以用75％的乙醇于-20度固定。

Q：（4）還要設(shè)什么內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)（5％雞紅細(xì)胞）嗎,？

A：對照肯定是需要的,，這個根據(jù)自己的需要進(jìn)行設(shè)置。

Q：（5）不用試劑盒行不行??？

A：*可以不用試劑盒,。

以下提供一個自己的實驗步驟供參考：

（1）200×g離心10min收集細(xì)胞；

（2）棄去上清,，PBS漂洗一次，將細(xì)胞重懸于預(yù)冷的80%乙醇中,，-20°C固定24h以上,；

（3）進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測前，200×g離心10min收集固定后的細(xì)胞,；

（4）PBS洗滌一次,，200×g離心10min收集細(xì)胞；

（5）將細(xì)胞重懸于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中,，室溫孵育30min,；

（6）將經(jīng)PI染色和RNase A消化后的細(xì)胞懸液用300目的尼龍膜過濾后即可利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分布和凋亡細(xì)胞定量的分析。

3.  Q：流式檢測細(xì)胞周期時加RNA酶所需的溫度,？

A：其實有關(guān)RNA酶在凋亡檢測制樣過程中使用的必要性問題尚有人持不同意見,，該觀點的人認(rèn)為RNA酶在環(huán)境中*，常規(guī)制樣過程中所接觸的試劑和環(huán)境中的RNA酶已足以降解樣品中的RNA,，所以為了簡便實驗操作,，也有人不加RNA酶或如你所參考的方法將其與PI染液一起使用。不過經(jīng)典的方法還是“先加RNA酶37度孵育30min,，然后加PI 4度孵育30min”,。

至于染色時使用4度，是因為低溫可減弱分子運動,，增強熒光染料結(jié)合的穩(wěn)定性和減少可能的熒光損耗,。上流式前細(xì)胞用75％乙醇固定行嗎？

4.  Q：我養(yǎng)腫瘤細(xì)胞,，測周期,。看到帖子說70％乙醇必須用PBS和乙醇配,，用水配細(xì)胞會碎裂,，有帖子說PBS和乙醇配會出現(xiàn)絮狀物。上流式前細(xì)胞用75％乙醇固定,，就用買來的現(xiàn)成的瓶裝75％乙醇,，行嗎？必須那么嚴(yán)格嗎,？

A：先用冷PBS懸浮細(xì)胞,，大約1-2ml，充分懸浮,，使細(xì)胞充分分散成單細(xì)胞,。之后緩慢加入無水乙醇,，終濃度為70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇會導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)聚的現(xiàn)象,，很難重懸成單細(xì)胞,。乙醇固定之后沒有細(xì)胞沉淀。

5.  Q：我要做流式分析細(xì)胞周期,，我大概收集了10的6次方細(xì)胞,，但細(xì)胞在乙醇固定之后，還看到有細(xì)胞沉淀的,，但PBS洗滌兩次之后,，就基本沒什么細(xì)胞沉淀了，上機發(fā)現(xiàn)就發(fā)現(xiàn)不了細(xì)胞了,。這是怎么回事?。吭趺唇鉀Q這個問題??？

A：很可能是洗細(xì)胞的過程中丟失了，解決辦法有：

（1）盡量采用尖底的離心管和水平離心機

（2）離心后盡量用吸管吸取上清,，不要傾倒,；吸上清時殘留1mm左右的水膜，不要吸完,。

（3）離心的轉(zhuǎn)速或時間可稍微增加一點兒

（4）每次加抗體時,，吸頭不要接觸液面；混勻時不要用吸頭吹打,，以免吸頭掛壁帶走部分細(xì)胞,。