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貼塊法適用于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)量低的、管徑較小血管的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，其方法較酶消化法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì),。但缺點(diǎn)使易混有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，前者的貼壁時(shí)間和內(nèi)皮接近,，后者貼壁較內(nèi)皮慢,，而且會(huì)被肝素所抑制。

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DMEM 胎牛血清 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 肝素鈉 青鏈霉素 明膠 胰蛋白酶 PBS D-Hanks’液

手術(shù)器械 眼科剪 眼科鑷 培養(yǎng)皿 手術(shù)刀 培養(yǎng)瓶 CO2培養(yǎng)箱

一、實(shí)驗(yàn)方法
1. 頸椎脫臼處死大鼠,，將整個(gè)大鼠浸泡于75%乙醇中消毒約1  min,。在無(wú)菌狀態(tài)下，逐層剪開(kāi)胸腔,，分離取出主動(dòng)脈,，放含無(wú)菌 D-Hanks’液培養(yǎng)皿中。

2. 用眼科剪,、鑷盡量去除血管外膜的脂肪和纖維組織,。然后,，用含抗生素的D-Hanks’液沖洗血管的外表面及血管腔內(nèi)的凝血數(shù)次,，再放入另一無(wú)菌培養(yǎng)皿中。

3. 用眼科剪縱向剪開(kāi)血管,，平展在培養(yǎng)皿中,。用非常銳利的手術(shù)刀將其切成1 mm³ 大小的動(dòng)脈植 塊(或者用剪刀剪，依照個(gè)人習(xí)慣),，然后種植到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿(培養(yǎng)瓶或皿用1%明膠預(yù)置 37℃下過(guò),， 使用前2  h 移入CO₂培養(yǎng)箱中。用時(shí)可以先經(jīng)含 10%小牛血清的培養(yǎng)液沖洗),。將動(dòng)脈植塊的內(nèi)膜面與瓶底接觸,，種植密度約為 1 塊/cm² 。

4. 置培養(yǎng)箱中靜置2 h(干貼壁),。然后,，加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培養(yǎng)液，液量以略蓋過(guò)動(dòng)脈植塊內(nèi)膜面,，而又不使植塊漂浮為宜,。24 h 后,，更換培養(yǎng)液，加入 2-3 ml 培養(yǎng)液,。

5. 72 h 左右的時(shí)候,，當(dāng)觀察到內(nèi)皮細(xì)胞充分長(zhǎng)出，而成纖維細(xì)胞剛要長(zhǎng)出的時(shí)候,，將動(dòng)脈植塊除去,，刮除成纖維細(xì)胞，換培養(yǎng)液1 次,。以后每2 天換液一次,，每次換1/2~1/3 的液量。繼續(xù)培養(yǎng) 8-10 d,， 細(xì)胞融合成單層,，即可傳代。

二,、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

植塊培養(yǎng)法進(jìn)行的原代培養(yǎng),，一般在培養(yǎng)2-3 天，動(dòng)脈植塊周圍即有細(xì)胞生長(zhǎng),，并漸向外延伸,，呈扁平短梭形或多角形；約8-10 d 后細(xì)胞融合成片,。采用vWF 免疫組化鑒定,，主要表達(dá)在細(xì)胞漿中。

一,、實(shí)驗(yàn)討論

植塊培養(yǎng)法適用于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)量低的,、管徑較小血管的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，其方法較酶消化法簡(jiǎn)便,、經(jīng)濟(jì),。但缺點(diǎn)使易混有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，前者的貼壁時(shí)間和內(nèi)皮接近,，后者貼壁較內(nèi)皮慢,，而且會(huì)被肝素所抑制。

而由于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)較快,，隨著傳代次數(shù)越多,，其污染的程度越重，從而使培養(yǎng)失敗,。因而,，抑制和減少成纖維細(xì)胞是大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵問(wèn)題。本法采用的方法是：

   
1. 在合適的時(shí)間去除動(dòng)脈塊，即當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)爬出,，初具規(guī)模時(shí)(大概在72 h 左右的時(shí)候,，按照本文的培養(yǎng)液條件，因?yàn)橛猩L(zhǎng)因子,，內(nèi)皮容易爬出和增殖),，去除動(dòng)脈塊，并刮除成纖維細(xì)胞,。

 
2. 使用含肝素的培養(yǎng)液(在培養(yǎng)液中加入100 U/ml 的肝素),，可使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高；

   
3. 高濃度的血清和50 µg/ml ECGF 可以充分地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,，而使內(nèi)皮細(xì)胞成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞,。另外，動(dòng)脈植塊干貼壁的時(shí)間不宜超過(guò)2 h,，而加培養(yǎng)液這一步驟尤為關(guān)鍵,，過(guò)少會(huì)使內(nèi)膜接觸不到培養(yǎng)液，過(guò)多則易使動(dòng)脈小塊漂浮,，導(dǎo)致貼壁失敗,。因此，干貼壁后加培養(yǎng)液,，加入少量高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液(0.5-1 ml),，可以避免這些問(wèn)題。

組織塊貼塊的時(shí)候,，不可避免會(huì)有一些塊貼的方向不是內(nèi)膜面,，那么zui后將爬不出內(nèi)皮，甚至長(zhǎng)出較多雜質(zhì)細(xì)胞,，需刮除,。

另外，部分塊即使大小合適,，方向也正確,，也可能爬不出來(lái),，去除組織塊的時(shí)候,，應(yīng)該以大局為重，看到內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)爬出較多,，而雜質(zhì)細(xì)胞也開(kāi)始爬出的時(shí)候,，就要果斷地去除組織塊了。72 h 只是個(gè)大概的時(shí)間,，初學(xué)者不可以拘泥,。