聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級會員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機(jī)：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號中華門大廈18樓D座
- 個性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
標(biāo)簽： 小鼠 胚胎 成纖維細(xì)胞 培養(yǎng)
小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)原代培養(yǎng)可以：（1）用于細(xì)胞保種,；（2）用于分子生物學(xué)研究；（3）用于基因治療相關(guān)研究。
實(shí)驗(yàn)方法
- 胰酶消化法1
- 胰酶消化法2
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 將小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）從機(jī)體中取出,，經(jīng)胰酶,、螯合劑（常用EDTA）處理,，分散成單細(xì)胞,，置MEF生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存,、生長和繁殖,。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 孕鼠 |
| 試劑、試劑盒 | PBS EDTA 胰酶 MEF生長培養(yǎng)基 FBS 高糖DMEM |
| 儀器,、耗材 | 眼科直剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃平皿3 尼龍濾網(wǎng) 離心管 手術(shù)刀片 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一,、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備 1. 動物 孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。 2. 試劑 無Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS),、0.05%胰酶,、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生長培養(yǎng)基(高糖DMEM加10%FBS),。 3. 器械 眼科直剪3把,、眼科直鑷3把、眼科彎鑷2把,、玻璃平皿3套、200目尼龍濾網(wǎng),、50 ml和15 ml離心管和手術(shù)刀片,。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。
1. 處死孕鼠,，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外一組剪刀,、鑷子剪開腹部肌層,，露出子宮，zui后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中,，沖洗去血,。
2. 用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟,，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中,，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS,，再重復(fù)此步驟一次,，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有D-PBS的平皿中,，并用手術(shù)刀片將其細(xì)細(xì)切碎,。
3. 用200 μl的移液槍反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體,，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中,，于4℃ 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清,，以10 ml胰酶重懸沉淀,，放在37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動,，使之充分消化,。
4. 將上層細(xì)胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后,，以1 500 rpm離心5分鐘收集細(xì)胞,，再用30 ml MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。
5. 細(xì)胞沉淀用15 ml MEF生長培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)(一般8只14天的胎鼠可獲得2-3×107細(xì)胞),。
6. 3×106細(xì)胞懸浮于15 ml MEF生長培養(yǎng)基中,，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。
7. 24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基,。
8. 細(xì)胞長滿后,，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長,，作者一般不超過五分鐘),，按1:5傳代。
9. 細(xì)胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后,，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配),。
小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF 100倍) 收起 |
| 注意事項(xiàng) | 1. 原代培養(yǎng)，一定要避免污染,。 2. MEF生存能力有限,，如果不凍存，體外存活十代左右,。 3. 凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞只能傳代一次,，因?yàn)檫@些細(xì)胞繁殖能力有限。 4. 消化細(xì)胞時間不要過長,。 |
