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回收試驗(yàn)，是“對(duì)照試驗(yàn)”的一種,。當(dāng)所分析的試樣組分復(fù)雜,，不*清楚時(shí)，向試樣中加入已知量的被測(cè)組分,，然后進(jìn)行測(cè)定,，檢查被加入的組分能否定量回收，以判斷分析過(guò)程是否存在系統(tǒng)誤差的方法,。所得結(jié)果常用百分?jǐn)?shù)表示,，稱為“百分回收率”，簡(jiǎn)稱“回收率”,。
實(shí)驗(yàn)方法
- 基本方案
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 蛋白質(zhì) |
|---|---|
| 試劑,、試劑盒 | SDS DTT 脫色液 染色液 |
| 儀器、耗材 | 電泳儀 透析膜 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 1. 凝膠浸泡在染色液中于室溫緩慢搖動(dòng)染色15~20 min,，然后移至脫色液中于4℃溫和搖動(dòng)下脫色2~3 h,。 2. 切下染色后的凝膠條帶，于4℃水中浸泡2~3 h,，期間換幾次水,。然后分別將每條膠移入Petri培養(yǎng)皿中，加入10 ml 水覆蓋之,，并將它們搗碎成約1 mm3的碎片,，再用巴斯德吸管將水吸千。 3. 用一園片狀的Spectrapor 6透析膜將電洗脫儀的洗脫池的底端蓋好,，并擰緊帽子  圖一,、洗脫池 4. 將搗碎的凝膠移入洗脫室的粗大的一端，并以浸泡緩沖液覆蓋,，在浸泡液之上,，加入一層冼脫液，使之剛沒過(guò)水平隧道,，排除氣泡,。 5. 將洗脫室置于洗脫池之內(nèi)，加入洗脫液至僅高于各電極槽的排液出口,， 將其余的液體加入小混合池中,。 6. 連接雙通道蠕動(dòng)泵，調(diào)整流速使溶液能緩饅地從混合池中滴回洗脫池,。用彎頭巴斯德吸管吸去洗脫室透析膜下的所有氣泡,，小心不要戳穿透析膜。 7. 將凝膠碎片浸泡3~5 h,。連接電極,，注意將陰極連接于冼脫室有凝膠碎片的一側(cè),。50 V 恒壓12~16 h。 8. 關(guān)電源,，撤去與電極的連接,，以透析液代替洗脫罐中的冼脫液。重新連接電極,，在80 V 恒壓下12?24,、 9. 關(guān)電源，撤去與電極的連接,，關(guān)閉蠕動(dòng)泵,。從罐中取出洗脫室,，吸去含洗脫蛋白的收集池中藍(lán)色蛋白層上面的緩沖液,，以帶平嘴針頭的50 μl 注射器混勻剩余的含蛋白液體。 10. 將蛋白溶液移入一微量離心管中,，用50 μl 透析液洗收集池,，并合并于蛋白液。 11. 在Speedvac蒸發(fā)器中凍干液體,，樣品可在-20℃保存,。  圖二,、洗脫儀及洗脫池 12. 樣品用100 μl 水重溶,，并以50：50甲醇/丙酮沉淀。-20℃過(guò),，微量離心沉淀蛋白,。 13. 取5%~10%樣品用Laemmli凝膠系統(tǒng)的微型膠分折蛋白冼脫的程度、分子量和回收率,，蛋白質(zhì)可用考馬斯亮藍(lán)或銀染法檢測(cè),。 14. 將剩余的樣品加樣于瀏序?yàn)V膜，用于蛋白質(zhì)序列分析,。 |
