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與直接原位PCR所不同的是,，靶基因在擴增時不進行標記基團的摻入,，而是標記一段與擴增片段互補的探針，在擴增結(jié)束后,，應(yīng)用此探針進行原位雜交,。因此,，此處主要介紹原位雜交，其余方法同原位PCR,。
一,、預雜交
1. 試劑與配制
2×SSC
50%去離子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）
預雜交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖,，50%甲酰胺,，0.2%脫脂奶粉
2. 操作方法
① 在進行完原位PCR擴增后，用2×SSC預浸經(jīng)乙醇脫水,、空氣干燥的玻片,，并簡洗15min；
② 用50%去離子甲酰胺37℃孵育15min,；
③加預雜交液20μl/片,，在雜交溫度下孵育30min～2hr。
二,、雜交
1. 試劑與配制
雜交液：50%去離子甲酰胺,，5×SSC，10%硫酸葡聚糖,，5×Denhardt’s 液,，2%SDS，10mg/ml變性的鮭魚精DNA
2. 操作方法
① 棄預雜交液,，加雜交液（含0.2～5μg/ml探針）10～20μl/片,，覆蓋經(jīng)硅化的蓋玻片，石蠟膜封片或橡皮泥封片,；
② 玻片置于濕盒中,，42℃雜交12～18hr（過，但不能超過24hr）,。
2. 注意事項
① 如果檢測mRNA,，雙鏈探針應(yīng)變性處理，方法是95～100℃加熱10min后迅速置于冰中驟冷,；
② 以單鏈探針檢測DNA時,，DNA也需變性處理，將玻片置于70～80℃變性液（70%去離子甲酰胺,，即甲酰胺/2×SSC,，v/v）中10min；
③ 用雙鏈探針檢測DNA時,，可按上述方法變性處理,。
三、雜交后處理
1. 試劑與配制
2×SSC
Rnase（20μg/ml）
50%去離子甲酰胺
10mmol/L DTT
2. 操作方法
① 雜交完畢,，用2×SSC浸泡玻片數(shù)分鐘,，輕輕移去蓋玻片,，再用2×SSC洗玻片1～2min；
② 2×SSC（含20μg/ml RNase,，適宜RNA探針,，DNA探針可省略此步）中洗片30min，37℃,；
③ 2×SSC/50%去離子甲酰胺,，42℃×10min,；
④1×SSC/50%去離子甲酰胺,，37℃×30min，2次,；
⑤ 4×SSC/10mmol/L DTT洗1hr,；
⑥ 0.1×SSC洗2次，每次37℃×30min,；
⑦ PBS中洗10min,，即可進行顯色，方法同上,。
