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本實(shí)驗(yàn)將應(yīng)用RFLP 分析技術(shù)檢測NMDA 受體中的GRIN2A 亞基基因3 號(hào)內(nèi)含子中的2 個(gè)SNP 位點(diǎn)rs17750303（A→C）和rs837690（A→G）,。
[實(shí)驗(yàn)原理]
DNA 限制性內(nèi)切酶具有識(shí)別特定的DNA 序列并在特定的部位切斷DNA 雙鏈的活性功能,，DNA分子由于突變（核苷酸的置換、插入或缺失）改變（或形成）了限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列,，使DNA 限制性內(nèi)切酶不能（或可以）將靶DN段切斷,，電泳檢測時(shí)，存在相應(yīng)DNA 限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列者原DNA 片段變成短片段,；不存在相應(yīng)DNA 限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列者原DNA 片段長度將不發(fā)生變化,。
[實(shí)驗(yàn)器材]
PCR 擴(kuò)增儀、電泳儀,、電泳槽,、微波爐、恒溫箱或恒溫水浴等,。
[實(shí)驗(yàn)試劑]
限制性內(nèi)切酶BstNI,、模板DNA、Taq聚合酶,、PCR引物（上游引物:5－CTAAGCCTTCCCTTTATCACC－3’,；下游引物：5－TTCACAGTCGTGCTTGTTTCT－3’）、丙烯酰胺,、酶消化緩沖液,、電極緩沖液、上樣緩沖液等,。
[實(shí)驗(yàn)方法]
1.PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為20μl,，含模板2μl（約50ng），引物各1.6μl,，dNTP1.6μl（0.4mM）,，10×Buffer緩沖液2μl，Taq酶0.5U,，加雙蒸水至20.0μl,；PCR反應(yīng)條件為95℃2min，94℃30sec/64℃30sec/72℃30sec（5個(gè)循環(huán)）,，94℃30sec/63℃30sec/72℃30sec（5個(gè)循環(huán)）,，94℃30sec/60℃30sec/72℃25sec（23個(gè)循環(huán)），94℃30sec/60℃30sec/72℃1min,。
2.PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物2μl，以1%的瓊脂糖凝膠潛水電泳法檢測靶DNA 片段的擴(kuò)增產(chǎn)物,。
3.酶消化反應(yīng)：取PCR 產(chǎn)物約2.0μl,，加限制性內(nèi)切酶BstN I1U，10×酶消化反應(yīng)緩沖液1.0μl,，蒸溜水補(bǔ)至10.0μl 置試驗(yàn)管中,。37℃溫箱中孵育4h,。
4.酶切產(chǎn)物電泳分型：6%聚丙烯酰胺凝膠電泳（T=6%，C=3.3%,，凝膠規(guī)格為82mm×64mm×0.75mm）,。電極緩沖液為1×TBE。將加有1/5體積上樣緩沖液的酶切產(chǎn)物電泳,，220 v 電壓,，電泳2－3h。
5.銀染顯色將凝膠剝離至染色盤中,，用10%冰醋酸固定30min,去除固定液,，用蒸餾水沖洗凝膠3 次（2min以內(nèi)）。將0.1%硝酸銀溶液200ml 倒入染色盤中,，染色30min,，倒掉染色液，蒸餾水快速?zèng)_洗凝膠1 次（20s以內(nèi)）,。顯色液200ml（3% Na2CO3,，含0.05%甲醛，2‰Na2S2O3）倒入染色盤中,，不斷震蕩,，直至譜帶顯示清晰。用固定液終止顯色,。蒸餾水洗滌一次,，貼于濾紙上晾干保存。
[結(jié)果判定]
本實(shí)驗(yàn)PCR 產(chǎn)物長度為379bp,，rs17750303 位點(diǎn)位于140bp 處,，為A/C突變。rs837690 位點(diǎn)位于175bp處,，為AG 突變,。兩個(gè)位點(diǎn)均為BstN I 酶識(shí)別部位，酶切后可以產(chǎn)生1-4（6 種）個(gè)DNA 片斷,，根據(jù)酶切片段數(shù)量與長度可出現(xiàn)10 種譜型（基因型組）見下表,。
根據(jù)酶切片段數(shù)量與長度確定rs17750303－rs837690 位點(diǎn)基因型組合
GRIN2A 基因rs17750303 與rs837690 位點(diǎn)的RFLP 電泳譜型
1.DNA 長度標(biāo)準(zhǔn)品；2.PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,；3.AA-AA 型,；4.C
C-AG 型；5.AC-AA型,,；6.AC-GG 型,，；7.CC-AA型；8.CC-GG 型,；9.AA-GG 型,；10.CA-AG 型。
[實(shí)驗(yàn)討論]
1.注意事項(xiàng) ①靶片段的擴(kuò)增產(chǎn)物要純,，如有非特異產(chǎn)物（特別是大片段可能含有酶識(shí)別序列）將競爭酶活性,，使樣品消化不*或及出現(xiàn)酶消化雜帶；②酶消化過程要充分（即底物與酶的比例要合適,，消化時(shí)間要保證）,，避免假陰性結(jié)果；③酶切陽性結(jié)果可以確定所檢測具體序列,，陰性結(jié)果僅可說明非酶識(shí)別序列,，但不能準(zhǔn)確判定具體序列。④酶識(shí)別序列如有甲基化之核苷酸將不被切割,。
