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本實驗將應用RFLP 分析技術(shù)檢測NMDA 受體中的GRIN2A 亞基基因3 號內(nèi)含子中的2 個SNP 位點rs17750303（A→C）和rs837690（A→G）,。
[實驗原理]
DNA 限制性內(nèi)切酶具有識別特定的DNA 序列并在特定的部位切斷DNA 雙鏈的活性功能,，DNA分子由于突變（核苷酸的置換,、插入或缺失）改變（或形成）了限制性內(nèi)切酶識別序列,，使DNA 限制性內(nèi)切酶不能（或可以）將靶DN段切斷,，電泳檢測時,，存在相應DNA 限制性內(nèi)切酶識別序列者原DNA 片段變成短片段；不存在相應DNA 限制性內(nèi)切酶識別序列者原DNA 片段長度將不發(fā)生變化,。
[實驗器材]
PCR 擴增儀,、電泳儀、電泳槽,、微波爐、恒溫箱或恒溫水浴等,。
[實驗試劑]
限制性內(nèi)切酶BstNI,、模板DNA、Taq聚合酶,、PCR引物（上游引物:5－CTAAGCCTTCCCTTTATCACC－3’,；下游引物：5－TTCACAGTCGTGCTTGTTTCT－3’）,、丙烯酰胺,、酶消化緩沖液,、電極緩沖液,、上樣緩沖液等,。
[實驗方法]
1.PCR擴增：PCR反應體系為20μl,，含模板2μl（約50ng）,，引物各1.6μl,，dNTP1.6μl（0.4mM）,，10×Buffer緩沖液2μl,，Taq酶0.5U，加雙蒸水至20.0μl,；PCR反應條件為95℃2min,，94℃30sec/64℃30sec/72℃30sec（5個循環(huán)），94℃30sec/63℃30sec/72℃30sec（5個循環(huán)）,，94℃30sec/60℃30sec/72℃25sec（23個循環(huán)）,，94℃30sec/60℃30sec/72℃1min。
2.PCR 擴增產(chǎn)物的檢測：取PCR 擴增產(chǎn)物2μl,，以1%的瓊脂糖凝膠潛水電泳法檢測靶DNA 片段的擴增產(chǎn)物,。
3.酶消化反應：取PCR 產(chǎn)物約2.0μl，加限制性內(nèi)切酶BstN I1U,，10×酶消化反應緩沖液1.0μl,，蒸溜水補至10.0μl 置試驗管中,。37℃溫箱中孵育4h。
4.酶切產(chǎn)物電泳分型：6%聚丙烯酰胺凝膠電泳（T=6%,，C=3.3%,，凝膠規(guī)格為82mm×64mm×0.75mm）。電極緩沖液為1×TBE,。將加有1/5體積上樣緩沖液的酶切產(chǎn)物電泳,，220 v 電壓，電泳2－3h,。
5.銀染顯色將凝膠剝離至染色盤中,，用10%冰醋酸固定30min,去除固定液，用蒸餾水沖洗凝膠3 次（2min以內(nèi)）,。將0.1%硝酸銀溶液200ml 倒入染色盤中,，染色30min，倒掉染色液,，蒸餾水快速沖洗凝膠1 次（20s以內(nèi)）,。顯色液200ml（3% Na2CO3，含0.05%甲醛,，2‰Na2S2O3）倒入染色盤中,，不斷震蕩，直至譜帶顯示清晰,。用固定液終止顯色,。蒸餾水洗滌一次，貼于濾紙上晾干保存,。
[結(jié)果判定]
本實驗PCR 產(chǎn)物長度為379bp,，rs17750303 位點位于140bp 處，為A/C突變,。rs837690 位點位于175bp處,，為AG 突變。兩個位點均為BstN I 酶識別部位,，酶切后可以產(chǎn)生1-4（6 種）個DNA 片斷,，根據(jù)酶切片段數(shù)量與長度可出現(xiàn)10 種譜型（基因型組）見下表。
根據(jù)酶切片段數(shù)量與長度確定rs17750303－rs837690 位點基因型組合
GRIN2A 基因rs17750303 與rs837690 位點的RFLP 電泳譜型
1.DNA 長度標準品,；2.PCR 擴增產(chǎn)物,；3.AA-AA 型；4.C
C-AG 型,；5.AC-AA型,,；6.AC-GG 型，,；7.CC-AA型,；8.CC-GG 型,；9.AA-GG 型；10.CA-AG 型,。
[實驗討論]
1.注意事項 ①靶片段的擴增產(chǎn)物要純,，如有非特異產(chǎn)物（特別是大片段可能含有酶識別序列）將競爭酶活性，使樣品消化不*或及出現(xiàn)酶消化雜帶,；②酶消化過程要充分（即底物與酶的比例要合適,，消化時間要保證），避免假陰性結(jié)果,；③酶切陽性結(jié)果可以確定所檢測具體序列,，陰性結(jié)果僅可說明非酶識別序列，但不能準確判定具體序列,。④酶識別序列如有甲基化之核苷酸將不被切割,。
