聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級會員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號中華門大廈18樓D座
- 個性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機商鋪
摘要： 本實驗介紹了脂質體轉染的幾個方法,。
實驗原理
脂質 體（LR）試劑是陽離子脂質體DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。它適用于把DNA 轉染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,，是目前條件下zui方面的轉染方法之一,。轉染率高，優(yōu)于磷酸鈣法,，比它高5-100倍,，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。
用LR進行轉染時,，首先需要優(yōu)化轉染條件,，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等,，對每批LR都要做,。先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h,，開始,，按這兩個參數(shù)繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者*的劑量,，確定出轉染時間,。因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24h為宜,。
細胞種類：COS-7,、BHK,、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞,。
實驗步驟
1. 操作步驟（方法一）：
1） 取6孔培養(yǎng)板,，向每孔中加入2ml含（1-2） x 105 個細胞的培養(yǎng)基，37℃,、18% CO2 培養(yǎng)基40%-60%匯合時,。
2） 轉染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液（為轉染1個空細胞所用的量）。
A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug,，終量100ul,。
B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR，使終濃度為2-50ug,，終量100ul,。
輕輕混合A液、B液,，室溫中置10-15min,，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉染,。
3） 轉染準備：用2ml不含血清培養(yǎng)基漂洗2次,，再加入1ml不含血清培養(yǎng)基。
4） 轉染：把A/B復合物緩緩加入培養(yǎng)基中,，搖勻,，置37℃溫箱中6-24h，吸除無血清轉染液,，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。
5） 其余處理：如觀察、篩選,、檢測等與其他轉染法相同,。
6） 注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響,。
2. 快速脂質體轉染法操作步驟（方法二）：
1） 將細胞以5 x 105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h,，使其達到50%-60%板底面積。
2） 在試管中配制DNA-脂質體復合物,。
a. 在1ml無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質粒DNA或供體DNA,。
b. 旋轉1s，再加入脂質體懸液,，旋轉,。
c. 室溫下放置5-10min，使DNA結合在脂質體上。
3） 棄去細胞中的舊液,，用1ml無血清DMEM洗細胞1次后棄去,，向每孔中直接加入1mlDNA-脂質體復合物，37℃培養(yǎng)3-5天,。
4） 再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,，繼續(xù)培養(yǎng)14-24h。
5） 吸出DMEM-DNA-脂質體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,，2ml/孔,，再培養(yǎng)24-48h。
6） 用細胞刮或消化法收集細胞,，以備分析鑒定,。
3. 穩(wěn)定的脂質體轉染法：
1） 接種細胞同前述，細胞長至50%板底面積可用于轉染,。
2） DNA-脂質體復合物制備轉染細胞同前,。
3） 在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM，37℃培養(yǎng)48h,。
4） 吸出DMEM,，用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細胞，使細胞生長 一定時間,，篩選轉染克隆,，方法參照細胞克隆篩選法進行。
4. Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉染單層貼壁細胞,。（別的方法可以參考生產(chǎn)商提供的protocol）
1） 轉染前1天將0.5～2×105細胞接種于24孔培養(yǎng)板，并加入500ul不含抗生素 的*培養(yǎng)基,，以保證轉染時細胞匯合達90～95％,。
2） 準備復合物
a. 將0.8ug DNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。
b. 將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中,，輕輕渾勻,，室溫孵育5分。注意：必須在25分內(nèi)進行,。
c. 5分后將它們混合,，并輕輕渾勻，室溫孵育20分,。
3） 吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基,，用PBS或無血清培養(yǎng)基（）清洗細胞2次。
4） 將復合物（總體積100ul）加入培養(yǎng)孔,，前后搖動培養(yǎng)板使其分布均勻,。
5） 將細胞放入培養(yǎng)箱 孵育4～6h后，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復合物（也可不用）,。
6） 24～48h后可以觀察轉入基因表達 情況,。
7） 穩(wěn)定轉染：換含血清培養(yǎng)基24h后將細胞以1：10（或更高比例）傳代,，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選。
8） 優(yōu)化：要保證細胞匯合率達90～95％（比較高）,；DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5,，一般細胞1：2～3。
