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一,、電轉化感受態(tài)細胞的制備
1.用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10ml LB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中,。（同時做培養(yǎng)基和槍頭的空白對照）
2.37℃,，220rpm,，培養(yǎng)14-16個小時,。
3.第二天,，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000ml LB液體培養(yǎng)基中,，37度，220rpm,，振搖2-3小時,，每半小時測一次OD，當OD值達到0.3-0.4時,，停止培養(yǎng),。
4.將菌液在冰上預冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500ml 預冷的離心杯中,，4℃,，2500rpm離心10分鐘。
5.棄上清,，離心杯中加入少量ddH2O,，使沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯,，4℃，4000rpm離心10分鐘,。
6.棄上清,，加少量滅菌水，重懸菌體,，再將水注滿離心杯,，4000rpm，4℃,，離心10min,。
7.棄上清，往離心杯中加入少量10%甘油（滅菌,，預冷）,，重懸菌體，再加滿10%甘油, 4℃, 4000rpm, 離心10min,。
8.棄上清,，每個離心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀懸浮后,，將菌液以300ul/管分裝于1.5ml的離心管中,，-80 ℃冰箱中保存。同時取100 μl感受態(tài)加0.01ng puc18直接電穿孔轉化,，檢測轉化效率,。
9. 次日觀察轉化子生長情況，并記錄,。
二,、連接產(chǎn)物純化
1．將連接產(chǎn)物轉移至一1.5ml Eppendorf管中,，加入下列試劑:
10μl of ddH2O
2μl of 3M NaAC（PH5.2）
50μl of 無水乙醇
輕輕混勻，稍微離心并將其置于-20℃放置1小時以上,；
2.4℃,，top Speed 離心30分鐘；
3.小心移去上清,，避免接觸到管底的沉淀物,；
4.加入500μl70%的乙醇，輕輕顛倒幾次洗滌沉淀（注：不要離心混勻）,；
5.4℃,，top Speed離心5分鐘；
6.小心移去上清,，將此Eppendorf管置空氣中直至無乙醇氣味,；
7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存,，-20℃長期保存?zhèn)溆茫?/p>
三,、電轉化
1.從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細胞，置于冰上解凍,；
2.取1 μl 純化后的質粒于一1.5ml的離心管中,，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預冷。
3.將40～100ul解凍的感受態(tài)細胞轉移至此1.5ml 的離心管中,，小心混勻,，冰上放置10min。
4.打開電轉儀,，調至Manual,，調節(jié)電壓為2.1KV。
5.將此混合物轉移至已預冷的電極杯中,，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進入電極杯的底部,；
6.將電極杯推入電轉化儀，按一下pulse鍵,，聽到蜂鳴聲后,，向電擊杯中迅速加入1000μl的SOC液體培養(yǎng)基，重懸細胞后,，轉移到1.5ml的離心管中,。
7．37℃，220－250rpm復蘇1小時,。
8. 取20μl轉化產(chǎn)物加160μlSOC涂板,，放于37℃溫室，過培養(yǎng),，次日查看轉化結果,。其余菌液加1：1的30%的甘油后混勻－80℃保存,。
注：每塊加有Amp的平板上均勻涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl,，IPTG 20 μl,。
四、電擊杯清洗流程
1.用清水將電擊杯稍沖一下,。
2.向電擊杯中加入的75%酒精浸泡2hr,。
3.棄去酒精，再用蒸餾水沖洗2~3遍,，然后用1ml的槍吸取超純水反復吹打電擊杯10遍以上,。
4.加入無水乙醇2ml于電擊杯中，浸泡30分鐘,。
5.棄去無水乙醇,，于通風廚內(nèi)揮干乙醇。
6.將清洗好的電擊杯放入-20 ℃冰箱內(nèi)待用,。
注：1．不同樣品使用的電機杯應分開,；
2．每周用1%酒精浸泡30分鐘。
