聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級會員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號中華門大廈18樓D座
- 個性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機商鋪
一、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備
1.用槍頭挑取單克隆菌落,，投入盛有10ml LB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中,。（同時做培養(yǎng)基和槍頭的空白對照）
2.37℃，220rpm,，培養(yǎng)14-16個小時,。
3.第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000ml LB液體培養(yǎng)基中,，37度,，220rpm，振搖2-3小時,，每半小時測一次OD,，當OD值達到0.3-0.4時，停止培養(yǎng),。
4.將菌液在冰上預冷30分鐘,，隨后將菌液分裝到500ml 預冷的離心杯中，4℃,，2500rpm離心10分鐘,。
5.棄上清，離心杯中加入少量ddH2O,，使沉淀懸浮后,，再將水注滿離心杯，4℃,，4000rpm離心10分鐘,。
6.棄上清，加少量滅菌水,，重懸菌體,，再將水注滿離心杯，4000rpm,，4℃,，離心10min。
7.棄上清,，往離心杯中加入少量10%甘油（滅菌,，預冷），重懸菌體,，再加滿10%甘油, 4℃, 4000rpm, 離心10min,。
8.棄上清，每個離心杯中加入5ml10%的甘油,，使沉淀懸浮后,，將菌液以300ul/管分裝于1.5ml的離心管中,，-80 ℃冰箱中保存。同時取100 μl感受態(tài)加0.01ng puc18直接電穿孔轉(zhuǎn)化,，檢測轉(zhuǎn)化效率,。
9. 次日觀察轉(zhuǎn)化子生長情況，并記錄,。
二,、連接產(chǎn)物純化
1．將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列試劑:
10μl of ddH2O
2μl of 3M NaAC（PH5.2）
50μl of 無水乙醇
輕輕混勻,，稍微離心并將其置于-20℃放置1小時以上,；
2.4℃,，top Speed 離心30分鐘,；
3.小心移去上清，避免接觸到管底的沉淀物,；
4.加入500μl70%的乙醇,，輕輕顛倒幾次洗滌沉淀（注：不要離心混勻）,；
5.4℃，top Speed離心5分鐘,；
6.小心移去上清,，將此Eppendorf管置空氣中直至無乙醇氣味；
7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀,，4℃短期保存,，-20℃長期保存?zhèn)溆茫?/p>
三、電轉(zhuǎn)化
1.從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細胞,，置于冰上解凍,；
2.取1 μl 純化后的質(zhì)粒于一1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預冷,。
3.將40～100ul解凍的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml 的離心管中,，小心混勻，冰上放置10min,。
4.打開電轉(zhuǎn)儀,，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.1KV,。
5.將此混合物轉(zhuǎn)移至已預冷的電極杯中,，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進入電極杯的底部；
6.將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀,，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后,，向電擊杯中迅速加入1000μl的SOC液體培養(yǎng)基,，重懸細胞后,，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。
7．37℃,，220－250rpm復蘇1小時,。
8. 取20μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加160μlSOC涂板，放于37℃溫室,，過培養(yǎng),，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。其余菌液加1：1的30%的甘油后混勻－80℃保存,。
注：每塊加有Amp的平板上均勻涂有X-Gal 80μl ,，SOC 80μl，IPTG 20 μl,。
四,、電擊杯清洗流程
1.用清水將電擊杯稍沖一下。
2.向電擊杯中加入的75%酒精浸泡2hr,。
3.棄去酒精,，再用蒸餾水沖洗2~3遍，然后用1ml的槍吸取超純水反復吹打電擊杯10遍以上,。
4.加入無水乙醇2ml于電擊杯中,，浸泡30分鐘。
5.棄去無水乙醇,，于通風廚內(nèi)揮干乙醇,。
6.將清洗好的電擊杯放入-20 ℃冰箱內(nèi)待用。
注：1．不同樣品使用的電機杯應分開,；
2．每周用1%酒精浸泡30分鐘,。
