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一、原理

1,、E .coli 表達(dá)系統(tǒng)

E .coli 是重要的原核表達(dá)體系,。在重組基因轉(zhuǎn)化入E .coli 菌株以后，通過溫度的控制,，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì),，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-PAGE 以檢測表達(dá)蛋白質(zhì)。

2,、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)

提高外源基因表達(dá)水平的基本手段之一,，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷,。常用的有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo),。本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代-β-D^-半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。

不同的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)方法并不*相同,，因啟動子不同,，誘導(dǎo)表達(dá)要根據(jù)具體情況而定。

二,、材料

1,、誘導(dǎo)表達(dá)材料

（1 ）LB （Luria—Bertani））培養(yǎng)基

酵母膏 （Yeast extract）5g 蛋白胨 （Peptone）10g

NaCl10g 瓊脂 （Agar）1-2%

蒸餾水 （Distilled water）1000ml pH 7.0

適用范圍：大腸桿菌

（2 ）IPTG 貯備液：2 g IPTG溶于10 ml 蒸餾水中，0 .22 μm 濾膜過濾除菌，分裝成1 ml /份,，－20 ℃ 保存,。

（3 ）l× 凝膠電泳加樣緩沖液：

50 mmol / L Tris -CI （pH 6 .8 ）

50 mmol / L DTT

2 % SDS （電泳級）

0.1 % 溴酚藍(lán)

10 % 甘油

2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料

1 ）酶溶法

（1）裂解緩沖液：

50 mmol / L Tris-CI （pH 8 .0 ）

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）,。

（3）10 mg / ml 溶菌酶,。

（4）脫氧膽酸。

（5）1 mg / ml DNase I,。

2 ）超聲破碎法

（1 ）TE 緩沖液,。

（2 ）2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：

100 mmol / L Tris-HCI （pH 8 .0 ）

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 % 溴酚藍(lán)

20 % 甘油

三、實(shí)驗(yàn)方案

1,、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)

（1 ）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因,。

（2 ）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌,。

（3 ）篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落,，提取質(zhì)粒DNA 作限制性內(nèi)切核酸酶圖譜，DNA 序列測定,，

確定無誤后進(jìn)行下一步,。

（4 ）如果表達(dá)載體的原核啟動子為PL 啟動子，則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時(shí),，使培養(yǎng)液的OD₆₀₀達(dá)0.4-0.6 ,，迅速使溫度升至42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ；如果表達(dá)載體的原核啟動子為tac 等,，則37 ℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時(shí)達(dá)到對數(shù)生長期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L,。繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h 。

（5 ）取上述培養(yǎng)液1 ml ,1000g 離心,，1 min ,，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后,，作SDS -PAGE 檢測,。

2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化

1 ）細(xì)菌的裂解

常用方法有：① 高溫珠磨法,；② 高壓勻漿,；③ 超聲破碎法；④ 酶溶法,；⑤ 化學(xué)滲透等,。前三種方法屬機(jī)械破碎法，并且方法① ,、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用,，后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛,。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實(shí)驗(yàn)步驟。

（1）酶溶法,。常用的溶解酶有溶菌酶,；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶,；蛋白酶,；殼多糖酶；糖昔酶等,。溶菌酶主要對細(xì)菌類有作用,，而其他幾種酶對酵母作用顯著。主要步驟為：

① 4 ℃ ,，5000rpm 離心,，15 min ，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液（100 ml ）,。棄上清,，約每克濕菌加3 ml 裂解緩沖液,，懸浮沉淀,。

② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，攪拌20 min ,；邊攪拌邊每克菌加4 mg 脫氧膽酸（在冷室中進(jìn)行）,。

③ 37 ℃ ，玻棒攪拌,，溶液變得粘稠時(shí)加每克菌20μL DNase I,。室溫放置至溶液不再粘稠。

（2 ）超聲破碎法,。聲頻為15-20 kHz 的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎,，在處理少量樣品時(shí)操作簡便，液體量損失較少,，同時(shí)還可對染色體DNA 進(jìn)行剪切,，大大降低液體的粘稠度。

① 收集1 L 誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌,，40 ℃ ,，5000r pm 離心，15 min ,；棄上清,，約每克濕菌加3 mlTE 緩沖液。

② 按超聲處理儀廠家提供的功能參數(shù)進(jìn)行破菌,；10 000g 離心,，15min ，分別收集上清液和沉淀。

③ 分別取少量上清和沉淀,，加入等體積的2× 凝膠電泳加樣緩沖液,，進(jìn)行SDS -PAGE 。

注意事項(xiàng)：超聲破碎與聲頻,、聲能,、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度,、菌種類型等因素有關(guān),，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前,，標(biāo)本經(jīng)3 -4 次凍溶后更容易破碎,。

2 ）包涵體的分離

蛋白質(zhì)在細(xì)菌中的高水平表達(dá)，常形成相差顯微鏡下可見到的細(xì)胞質(zhì)顆粒,，即為包涵體,，經(jīng)離心沉淀后可用Triton-X10⁰ / EDTA 或尿素洗滌，若為獲取可溶性的活性蛋白,，須將洗滌過的包涵體重新溶解并進(jìn)行重折疊,。

（1）試劑與配制

① 洗滌液I：

0.5 % Triton X -100

10 mmol / L EDTA （pH 8 .0 ）

溶于細(xì)胞裂解液中。

② 2×凝膠電泳加樣緩沖液,。

（2）細(xì)胞裂解混合物12 000g 離心,，15 min ,4 ℃ ；棄上清,，沉淀用9× 洗滌液l 懸?。皇覝胤胖? min ; 12 000g 離心15 min ,4 ℃ ,；吸出上清,，用100 μL 水重新懸浮沉淀；分別取10 μL上清和重新懸浮的沉淀,，加10 μL 2× 凝膠電泳加樣緩沖液,，進(jìn)行SDS-PAGE 。

3 ）包涵體的溶解和復(fù)性

（1）試劑與配制

① 緩沖液I：

1 mmol / L PMSF

8mol /L 尿素

10 mmol / L DTT

溶于前述裂解緩沖液中,。

② 緩沖液Ⅱ：

50 mmol / L KH₂PO₄

1 mmol / L EDTA （pH 8 .0 ）

50 mmol / L NaCI

2 mmol / L 還原型谷胱甘肽

1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽

③ KOH 和HCI ,。

④ 2×凝膠電泳加樣緩沖液。

（2）用100 μL 緩沖液I 溶解包涵體,；室溫放置lh ,；加9×緩沖液Ⅱ，室溫放置30 min ,，用KOH 調(diào)pH 到10.7 ,；用HCI 調(diào)至pH 8 .0 ,，在室溫放置至少30 min ; 1000g 離心，15 min ,，室溫,；吸出上清液并保留，用100 μL 2×凝膠電泳加樣緩沖液溶解沉淀,；取10 μL 上清,，加10 μL 2× 凝膠電泳加樣緩沖液，與20 μL 重新溶解的沉淀進(jìn)行SDS-PAGE ,。

四,、注意事項(xiàng)

（1）不同的大腸桿菌表達(dá)載體帶有不同的啟動子和誘導(dǎo)成分。實(shí)驗(yàn)者必須根據(jù)特定系統(tǒng)和用途決定相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案,。

（2）表達(dá)和檢測時(shí),，應(yīng)設(shè)置對照組，如轉(zhuǎn)化載體和非誘導(dǎo)細(xì)胞,。

（3）由于大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)缺少哺乳動物細(xì)胞特異的翻譯后加工,，所以，其生物活性無法與天然蛋白質(zhì)相提并論,。