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摘要： 本實(shí)驗(yàn)介紹了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的幾個(gè)方法,。
實(shí)驗(yàn)原理
脂質(zhì) 體（LR）試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。它適用于把DNA 轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,，是目前條件下zui方面的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高,，優(yōu)于磷酸鈣法,，比它高5-100倍,，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。
用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí),，首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等,，對每批LR都要做,。先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1-5ug和孵育時(shí)間6h,，開始,，按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者*的劑量,，確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間,。因LR對細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過24h為宜,。
細(xì)胞種類：COS-7,、BHK、NIH-3T3,、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞,。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 操作步驟（方法一）：
1） 取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2ml含（1-2） x 105 個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基,，37℃,、18% CO2 培養(yǎng)基40%-60%匯合時(shí)。
2） 轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液（為轉(zhuǎn)染1個(gè)空細(xì)胞所用的量）,。
A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug,，終量100ul。
B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR,，使終濃度為2-50ug,，終量100ul。
輕輕混合A液,、B液,，室溫中置10-15min，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象,，但并不妨礙轉(zhuǎn)染,。
3） 轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2ml不含血清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入1ml不含血清培養(yǎng)基,。
4） 轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)基中,，搖勻，置37℃溫箱中6-24h,，吸除無血清轉(zhuǎn)染液,，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。
5） 其余處理：如觀察、篩選,、檢測等與其他轉(zhuǎn)染法相同,。
6） 注意：轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加血清，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響,。
2. 快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟（方法二）：
1） 將細(xì)胞以5 x 105個(gè)/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h,，使其達(dá)到50%-60%板底面積。
2） 在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物,。
a. 在1ml無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA,。
b. 旋轉(zhuǎn)1s，再加入脂質(zhì)體懸液,，旋轉(zhuǎn),。
c. 室溫下放置5-10min，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上,。
3） 棄去細(xì)胞中的舊液,，用1ml無血清DMEM洗細(xì)胞1次后棄去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂質(zhì)體復(fù)合物,，37℃培養(yǎng)3-5天,。
4） 再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14-24h,。
5） 吸出DMEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,，2ml/孔，再培養(yǎng)24-48h,。
6） 用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞,，以備分析鑒定。
3. 穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：
1） 接種細(xì)胞同前述,，細(xì)胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染,。
2） DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前。
3） 在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM,，37℃培養(yǎng)48h,。
4） 吸出DMEM，用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞,，使細(xì)胞生長 一定時(shí)間,，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進(jìn)行,。
4. Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉(zhuǎn)染單層貼壁細(xì)胞,。（別的方法可以參考生產(chǎn)商提供的protocol）
1） 轉(zhuǎn)染前1天將0.5～2×105細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板,，并加入500ul不含抗生素 的*培養(yǎng)基,，以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合達(dá)90～95％,。
2） 準(zhǔn)備復(fù)合物
a. 將0.8ug DNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。
b. 將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中,，輕輕渾勻,，室溫孵育5分。注意：必須在25分內(nèi)進(jìn)行,。
c. 5分后將它們混合,，并輕輕渾勻，室溫孵育20分,。
3） 吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基,，用PBS或無血清培養(yǎng)基（）清洗細(xì)胞2次。
4） 將復(fù)合物（總體積100ul）加入培養(yǎng)孔,，前后搖動培養(yǎng)板使其分布均勻,。
5） 將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱 孵育4～6h后，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復(fù)合物（也可不用）,。
6） 24～48h后可以觀察轉(zhuǎn)入基因表達(dá) 情況,。
7） 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：換含血清培養(yǎng)基24h后將細(xì)胞以1：10（或更高比例）傳代，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選,。
8） 優(yōu)化：要保證細(xì)胞匯合率達(dá)90～95％（比較高）,；DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5，一般細(xì)胞1：2～3,。
