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Northern blot 是一種通過檢測RNA的表達水平來檢測基因表達的方法,，通過northernblot的方法可以檢測到細胞在生長發(fā)育特定階段或者脅迫或病理環(huán)境下特定基因表達情況,。Northern blot 首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據(jù)其分子量大小加以區(qū)分，然后通過與特定基因互補配對的探針雜交來檢測目的片段,。
實驗方法
- Northern blot技術(shù)
- Northern Blot
| 實驗方法原理 | Northern blot的基本概述是將RNA樣品通過變性瓊脂糖凝膠電泳進行分離,，再轉(zhuǎn)移至尼龍膜等固相膜載體上，用放射性或非放射性標記DNA或RNA特異性探針對固定于固相膜上的mRNA進行雜交,，洗膜去除非特異性結(jié)合雜交信號,，經(jīng)放射自顯影或現(xiàn)色反應，對雜交信號進行分析,。將雜交的mRNA分子在電泳中遷移位置與標準分子量分子進行比較,，即可知道細胞中特定的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小,；對雜交信號的強弱比較,，可以知曉該基因表達mRNA水平的強弱。 |
|---|---|
| 實驗材料 | DNA |
| 試劑,、試劑盒 | MOPS電泳buffer 甲醛凝膠加樣buffer EB EGFR探針 DIG SSC |
| 儀器,、耗材 | 水平電泳儀 制冰機 恒溫水浴箱 凝膠成像系統(tǒng) EP管 移液器 Tip頭 |
| 實驗步驟 | 一、RNA轉(zhuǎn)移與固定 1. 變性瓊脂糖電泳分離總RNA樣品完成后,，1×MOPS buffer淋洗凝膠片刻,，10×SSC中浸泡平衡凝膠30 min,。 2. 按southern blot實驗中DNA轉(zhuǎn)移方法及裝置轉(zhuǎn)移總RNA至尼龍膜上（過程中注意無RNA酶操作）。 3. 1×SSC淋洗尼龍膜后濾紙吸干,，夾在2層干凈濾紙中80℃烤箱烘烤2小時,。 4. RNA染色，干燥的尼龍膜先于5%冰乙酸中室溫浸泡15 min,。 5. 于0.5 mol/L 乙酸鈉和0.04%亞甲藍溶液中浸泡5~10 min,。 6. 去離子水淋洗膜5~10 min，可見RNA標準及28s及18 sRNA的條帶,，軟鉛筆標記,。 二、預雜交,、雜交及顯色 1. Washing buffer潤洗1遍（3~5 min）,。 2. 100 ml blocking buffer工作液封閉30 min。 3. 100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min,。 4. Washing buffer洗膜（15 min×2）,。 5. 20 ml detection buffer 平衡2~5 min。 6. 將尼龍膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中,，避光數(shù)min至1天（出現(xiàn)顏色時不要搖動）,。 7. 當出現(xiàn)條帶時，TE-buffer洗膜（5 min×1）,，終止現(xiàn)色,。 8. 照相記錄，80℃烤干,，儲存,。 9. 掃描計算EGFR基因擴增的倍數(shù)。 |
| 注意事項 | 1. 避免RNA酶污染,，防止RNA降解,。 2. 凝膠中不要加入EB，以免降低雜交的效率,。 3. 為降低膜雜交本底,，可適當延長預雜交時間。 |
