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完整RNA 的提取和純化，是進行RNA 方面的研究工作，如Nothern雜交、mRNA 分離,、RT-PCR、定量PCR,、cDNA合成及體外翻譯等的前提,。所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關鍵點，即１）：樣品細胞或組織的有效破碎,；２）,，有效地使核蛋白復合體變性；３）,，對內源ＲＮＡ酶的有效抑制,；４）有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；5）,，對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去,。但其中zui關鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑,，1）,，提取總核酸，再用氯化鋰將RNA 沉淀出來,；2）,，直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質進入有機相而RNA 留在水相,。*種提取方法將導致小分子量RNA 的丟失,，目前該方法的使用頻率已很低。

方法一:總RNA 的試劑盒快速提取

一些公司推出的總RNA 提取試劑盒,，可以用來制備高質量的可用于建庫的RNA ,。該總RNA 純化系統(tǒng)采用兩種的RNA 酶抑制劑，異硫氰酸?。℅TC）和β-巰基乙醇,，加上整個操作都在冰浴下進行，這樣就能顯著降低RNA 的降解速率,。GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用,，將促使核蛋白復合體的解離，使RNA 與蛋白質分離,，并將RNA 釋放到溶液中,。而進一步從復合體中純化RNA ，則根據(jù)Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進行,，采用酸性酚-氯仿混合液抽提,。低pH值的酚將使RNA 進入水相，這樣使其與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離,。水相中的RNA 可用異丙醇沉淀濃縮,。進一步將上述RNA 沉淀復溶于GTC溶液中，接著用異丙醇進行二次沉淀,，隨后用乙醇洗滌沉淀,，即可去除所有殘留的蛋白質和無機鹽，而RNA 中如含無機鹽,，則有可能對以后操作中的一些酶促反應產生抑制,。

一：儀器

恒溫水浴,，冷凍高速離心機，紫外分光光度計,，取液器,，電泳儀，電泳槽,。

二：試劑

RNA 提取試劑盒,，0.05%焦碳酸二乙酯（DEPC），75%乙醇

操作步驟

（一）:細胞或組織破碎

A:微生物材料

１：發(fā)酵３－４天（或對數(shù)生長期）的菌體,，離心收集菌絲體（動植物材料無需此步處理）

２：用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體２－３次,，并盡量除去殘存的水

３：加液氮充分研磨，使其成為粉末,，以釋放RNA

４：研磨后的樣品轉移至１２ml變性液的容器中勻漿,。

B:動植物細胞培養(yǎng)材料 （適用的樣品量為細胞:108）

1:細胞或組織培養(yǎng):按常規(guī)方法進行

2:深層懸浮培養(yǎng)細胞的破碎:

（1）細胞收集:含一定濃度的細胞培養(yǎng)液置于無菌離心管中，4℃,，3000g離心5分鐘

（2）細胞洗滌:上步沉淀用25毫升滅菌后冰凍的1×PBS緩沖液洗滌,，然后4℃，3000g離心5分鐘,，

（3）細胞破碎:在沉淀細胞中加入15毫升預冷的變性液,，用無菌處理過的勻漿器勻漿

3:表面培養(yǎng)細胞的破碎:

（1）確定培養(yǎng)瓶數(shù)量，使選定的各培養(yǎng)瓶細胞累加后總量達108

（2）細胞收集:將培養(yǎng)液倒掉,，用預冷的無菌PBS緩沖液洗滌一次,，在培養(yǎng)瓶中加入8毫升預冷變性液，轉動培養(yǎng)瓶,，使細胞溶解,，此時可見粘度加大。

（3）用無菌吸管將*個培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個培養(yǎng)瓶,，旋轉,，溶解細胞，再吸入第三個培養(yǎng)瓶,，以此類推,，直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次，然后從*個培養(yǎng)瓶開始再加入4毫升上述變性液,，將所有培養(yǎng)瓶洗一次,。

（4）將上述12毫升含細胞的變性液轉移至一50毫升無菌離心管中，勻漿破碎細胞,。

C:植物組織破碎 （適用的樣品量為0.05g組織）

（1）將600ul變性液置于1.5ml離心管中,，將此離心管放于冰浴中5分鐘。

（2）將0.05g新鮮組織用液氮冰凍

（3）在液氮下，研磨組織塊

（4）待液氮揮發(fā)后,，將上述分散的組織轉移至無菌離心管中,。

D:動物組織破碎 （適用的樣品量為1克組織）

（1）將12毫升變性液置于50毫升離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘,。

（2）在上述管中加入1克新鮮或冰凍動物組織,，勻漿粉碎。

注1:研磨組織塊用于RNA 提取的樣品,，必須是新鮮的細胞或組織，如采樣后,，不能立即用于提取則樣品應用液氮速凍并貯于-70℃的冰箱中保存,。

2:變性液及相應的離心管需預冷。

（二）:RNA 的抽提

在經(jīng)變性液勻漿的細胞或組織600ul＋60ulpH4.0的2M乙酸鈉*混勻,，可用漩渦振蕩器,。

600ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），*混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒,。

冰裕中10-15分鐘,，離心，4℃,，10000g,，20分鐘。

上層水相吸至無菌離心管中+等體積的異丙醇,，-70℃,，30分鐘沉淀RNA。

離心4℃,，10000g,，20分鐘。

沉淀RNA ,，冷凍干燥15分鐘 ,， RNA 沉淀重新溶于300ul變性液中，可振蕩（有時為了幫助溶解,，可在65℃加熱,，但時間應極短）。

60ulpH4.0的2M乙酸鈉*混勻,，可用漩渦振蕩器,。

600ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），*混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒,。

冰裕中10-15分鐘,，離心，4℃，10000g,，20分鐘,。

上層水相吸至無菌離心管中。

等體積異丙醇二次沉淀（-70℃,，30分鐘）,，７５％乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥,，復溶于去RNA 酶的水中（對于準備長期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25M,，再加入2.5體積的乙醇，－７０℃保存,。）

注：1變性液組成：25g異硫氰酸胍溶于33mlCSB（42mM pH4.0乙酸鈉,、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2mM β-巰基乙醇）,，65℃溶解,，過濾滅菌，4℃預冷,。

2酸性酚配制：55℃時,，500g酚溶入500ml50mM，pH4.0乙酸鈉,，混勻,，靜止分層后，去上清,，再反復加500ml50mM,，pH4.0乙酸鈉，直到pH<4.1,。

方法二: 氯化鋰法提取總RNA

本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA 酶,，用氯化鋰選擇沉淀RNA ，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA ,，具有快速簡潔的長處,，但也存在少量DNA的污染及RNA 得率不高，小RNA 片斷丟失的缺陷,。

儀器： 同上

試劑：

氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g（3M） 尿素,、360g（6M） 加水至1L，過濾滅菌】

懸浮液【10mM  Tris-HCL （pH7.6） ,，1mM  EDTA （pH8,，0） ，0.5%SDS】

其余同上

操作步驟：

1：對于大量組織或細胞,，則每克組織或細胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液,，勻槳器高速勻槳2分鐘；對于少量細胞（107個細胞/ml），則每克組織或細胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻槳,，并轉移至Eppendof管中

2：勻槳液在0－4℃放置4小時后,，12000g離心30分鐘

3：取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液,，重復步驟2

4：沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液復溶后,，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15－30分鐘并不時搖動混勻，4000g離心5分鐘

5：取上層水相,，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇,，－20℃放置1小時，5000g離心,。

6：70%乙醇洗沉淀一次,。真空干燥。

7：RNA 溶解液溶解沉淀,，得RNA ，分裝,，于－70℃保存,。