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一,、DNA的限制性酶切實(shí)驗(yàn)原理
核酸限制性內(nèi)切酶 是一類能識別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn),，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng),， 用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲。
限制性內(nèi)切酶 以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵,， 產(chǎn)生的ＤＮＡ段５’端為Ｐ,，３’端為ＯＨ。
1. 限制性內(nèi)切酶的類型
根據(jù)限制酶的識別切割特性,， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ,、Ⅱ、Ⅲ型三大類,。
*類（I型）限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸 順序,，它們在識別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈，但是切割的核苷酸 順序沒有專一性，是隨機(jī)的,。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大,，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB,、EcoK等,。
第三類（III型）限制性內(nèi)切酶也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對的固定位置上切割雙鏈,。但這幾個(gè)核苷酸對也不是特異性的,。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA段,，具有各種單鏈末端。因此也不能應(yīng)用于基因克隆,。
第三類（Ⅱ型）限制性內(nèi)切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性內(nèi)切酶.
它們能識別雙鏈ＤＮＡ的特異順序,，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的ＤＮＡ段,；
Ⅱ型酶分子量較小,，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識別順序一般為４～６個(gè)堿基對的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序,；
Ⅱ型內(nèi)切酶切割雙鏈ＤＮＡ產(chǎn)生３種不同的切口--５’端突出,；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,， 才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質(zhì)ＤＮＡ進(jìn)行改造,，從而極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。
粘性末端：是交錯(cuò)切割,，結(jié)果形成兩條單鏈末端,，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵,，所以稱為粘性末端,。
如EcoRI的識別順序?yàn)椋?br />5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置切割后生成
5’……G AATTC……3’
3’……CTTAA G……5’
各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的,，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶 的作用而“粘合”,。
平頭末端：
II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端,。例如EcoRV 的識別位置是：
5’…… GAT|ATC …… 3’
3’…… CTA|TAG …… 5’
切割后形成
5’…… GAT ATC …… 3’
3’…… CTA TAG …… 5’
這種末端同樣可以通過DNA連接酶 連接起來,。
2. 限制性核酸內(nèi)切酶的命名法
用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母表示寄主菌的物種名稱，如E. coli 用Eco表示,，所以用斜體字,。
用一個(gè)字母代表菌株或型，如流感嗜血菌（Heamophilus influenzae）Rd菌株用d，即Hind,。
如果一種特殊的寄主菌株,，具有幾個(gè)不同的限制與修飾酶，則以羅馬數(shù)字表示,，如HindⅠ, HindⅡ,，HindⅢ等。
