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1.探針的標記：
（1） 如下設置探針標記的反應體系：
待標記探針 （1.75pmol/微升） 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升
T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升） 1微升
總體積 10微升
按照上述反應體系依次加入各種試劑，加入同位素后,，Vortex混勻,，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻,。
（2） 使用水浴或PCR儀,，37℃反應10分鐘。
（3） 加入1微升探針標記終止液,，混勻,，終止探針標記反應。
（4） 再加入89微升TE,混勻,。此時可以取少量探針用于檢測標記的效率,。通常標記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標 記到了探針上,。為實驗簡便起見,，通常不必測定探針的標記效率,。
（5） 標記好的探針立即使用,，zui長使用時間一般不宜超過3天,。標記好的探針可以保存在-20℃。
2.探針的純化：
通常為實驗簡便起見,，可以不必純化標記好的探針,。在有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果,。如需純化,，可以按照如 下步驟操作：
（1） 對于100微升標記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨,，再加入2體積即200微升的無水乙醇,，混勻。
（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時,，或在-20℃沉淀
（3） 在4℃,，12000g-16000g離心30分鐘。小心去除上清,，切不可觸及沉,。
（4） 在4℃，12000g-16000g離心1分鐘,。小心吸去殘余液體,。微晾干沉淀，但不宜過分干燥,。
（5） 加入100微升TE,，*溶解沉淀。標記好的探針立即使用,，zui長使用時間一般不宜超過3天,。標記好的探針可以保存于-20℃。
3.EMSA膠的配制：
（1） 準備好倒膠的模具,?？梢允褂贸Ｒ?guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當?shù)哪＞?。選擇可以灌制較薄膠的模具,，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果,，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具,。
（2） 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠（注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大）。
TBE buffer （10X） 1毫升
重蒸水 16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide （40%,w/v） 2毫升
80% 甘油 625微升
10% 過硫酸銨 （ammonium persulfate） 150微升
TEMED 10微升
（3） 按照上述次序加入各個溶液,，加入TEMED前先混勻,，加入TEMED后立即混勻,，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡,， 并加上梳齒,。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理,。
4.EMSA結(jié)合反應：
（1） 如下設置EMSA結(jié)合反應：
陰性對照反應：
Nuclease-Free Water 7微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 0微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
樣品反應：
Nuclease-Free Water 5微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
探針冷競爭反應：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
未標記的探針 1微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
突變探針的冷競爭反應：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
未標記的突變探針 1微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
Super-shift反應：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
目的蛋白特異抗體 1微升
標記好的探針 1微升
總體積 10微升
（2） 按照上述順序依次加入各種試劑 ,在加入標記好的探針前先混勻,，并且室溫（20-25℃）放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合,，或者讓冷探針優(yōu)先反應,。然后加入標記好的探針，混勻,，室溫（20-25℃）放置20分鐘,。
（3） 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（無色，10X）,，混勻后立即上樣,。注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結(jié)合，建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液,。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣,，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍色的上樣緩沖液，至能觀察到藍顏色即可,。
5. 電泳分析：
（1） 用0.5XTBE作為電泳液,。按照10V/厘米的電壓預電泳10分鐘。預電泳的時候如果有空余的上樣孔,，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液（藍色）,，以觀察電壓是否正常進行。
（2） 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi),。在多余的某個上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 （藍色）,，用于觀察電泳進行的情況。
（3） 按照10V/厘米的電壓電泳,。確保膠的溫度不超過30℃,，如果溫度升高,，需要適當降低電壓,。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處,，停止電泳。
（4） 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙,。小心取下夾有EMSA膠的膠板,，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊（注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板）,，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個EMSA膠,，輕輕把濾紙和膠壓緊,。濾紙被膠微微浸濕后（大約不足1分鐘），輕輕揭起濾紙,，這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來,。把濾紙側(cè)向下，放平,，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜,，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。
（5） 干膠儀器上干燥EMSA膠,。然后用X光片壓片檢測，或用其它適當儀器設備檢測,。
