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專題:脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法

2013-7-8　　閱讀(1516)

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脂質(zhì)體（lipofectin regeant,LR）試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2,，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1:1（w/w）],。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,，是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高,，優(yōu)于磷酸鈣法,，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞,。

用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí),，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量,、作用時(shí)間等,，對每批LR都要做：*，先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間,，DNA可從1～5μg和孵育時(shí)間6小時(shí)開始,，按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者*的劑量,，確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間（2～24小時(shí)）,。因LR對細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過24小時(shí)為宜,。

細(xì)胞種類：COS-7,、BHK、NIH3T3,、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞,。

一、操作步驟[方法一]：

1. 取6孔培養(yǎng)板（或用35mm培養(yǎng)皿）,，向每孔中加入2mL含1～2×105 個(gè)液,，37℃CO2  培養(yǎng)至40%～60%匯合時(shí)（匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞）,。

2. 轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液（為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量）A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA,，終量100μL，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR,，終量100μL,，輕輕混合A、B液,，室溫中置10-15分鐘,，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染（如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致,，應(yīng)酌情減量）,。

3. 轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次,，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。

4. 轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中,，搖勻,，37℃溫箱置6～24小時(shí)，吸除無血清轉(zhuǎn)染液,，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),。

5. 其余處理如觀察、篩選,、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同,。

注意：轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加血清，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響,。

二,、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]：

1. 以5×105 細(xì)胞/孔接種6孔板（或35mm培養(yǎng)皿）培養(yǎng)24小時(shí)，使其達(dá)到50～60%板底面積,。

2. 在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：

①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA,。

②旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液,，旋轉(zhuǎn),。

③室溫下放置5～10分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上,。

3. 棄去細(xì)胞中的舊液,，用1mL無血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物,，37℃培養(yǎng)3～5小時(shí),。

4. 再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14～24小時(shí),，

5. 吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM,，2mL/孔，再培養(yǎng)24～48小時(shí),。

6. 用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞,，以備分析鑒定。

四,、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

1. 接種細(xì)胞同前,，細(xì)胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

2. DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前2,、3步驟,。

3. 在每孔中加入1mL,、20%FCS的DMEM,，37℃培養(yǎng)48小時(shí),。

4. 吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞,，使細(xì)胞生長一

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