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1.取出小鼠后瀝干酒精，放入超凈臺內(nèi),，固定在泡沫板上,。
2.用鑷子提起皮膚，用解剖剪剪開皮膚一個(gè)橫切口,，將皮膚向上撕開,，然后剪開肌肉等，暴露出腹腔,，在左側(cè)找到脾臟,，用彎頭眼科鑷取出脾臟，置于無菌培養(yǎng)皿中,。
3.用生理鹽水將取出的脾臟清洗多次,，并剔除多余無用的組織。
4.將篩網(wǎng)置于平皿中,，脾臟置于篩網(wǎng)上,，用彎頭鑷鑷住，輕輕在篩網(wǎng)上進(jìn)行碾磨,，同時(shí)不停滴加不含血清的培養(yǎng)液沖洗,。
5.將碾磨好的細(xì)胞懸液吸入至離心管中，離心（1000rpm,5min）,，吸去上清（去除血液等）,。
6.加入10ml培養(yǎng)液，吹打混勻,，取樣計(jì)數(shù),。
7.將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃混勻,，在培養(yǎng)瓶上,。
面做好標(biāo)志，注明細(xì)胞,、組別及日期,。然后將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),，確定細(xì)胞是否需要傳代,。
2.培養(yǎng)液瓶打開后，過酒精燈火焰,，置酒精燈火焰周圍,。
3.拿出直頭滴管，套上橡皮吸頭,，過火,，放入培養(yǎng)液瓶中,。
4.打開培養(yǎng)瓶，瓶口過火,，將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液輕輕倒入廢液缸,，用2-3mLPBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基。
7.對半貼壁培養(yǎng)細(xì)胞,，不需胰酶，直接吹打,，加入新鮮培養(yǎng)基,，然后分裝到各瓶中。
o冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序之程序降溫機(jī)中每分鐘降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮長期保存,。
1.取出冷凍管,，立即放入37℃水浴箱中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，移入無菌操作臺內(nèi),。
4.加適當(dāng)培養(yǎng)液后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng),，第二天觀察生長情況,。
1.一只小鼠可獲得（1～2.5）×108個(gè)脾細(xì)胞,。
2.細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁,，并開始生長，如接種的細(xì)胞密度適宜,，5天到一周即可形成單層,。
3.一般情況，傳代后的細(xì)胞在2小時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上,，2～4天就可在瓶內(nèi)形成單層,，需要再次進(jìn)行傳代。
1.取材要求新鮮,，無菌，解剖小鼠時(shí),，注意不要損傷脾臟及其周圍的臟器,，尤其是腸道等，防止污染脾臟,。
2.沖洗脾臟時(shí)要盡量洗凈血污,，去除無用組織，并要防止組織干燥,。
3.碾磨后及時(shí)用清水沖洗篩網(wǎng),，防止組織、細(xì)胞阻塞網(wǎng)孔,。
4.計(jì)數(shù)前,，注意吸盡平皿里的細(xì)胞，充分混勻,，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞,。
5.實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作,。
6.金屬器械不能在火焰中燒的時(shí)間過長,，燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織,，以免造成組織損傷。
7.另外膠塞過火焰時(shí)也不能時(shí)間長,，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體,，危害培養(yǎng)細(xì)胞。
8.吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼,，因殘留在吸管頭中營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜,，再用時(shí)會把有害物帶入營養(yǎng)液中。
9.不能用手觸及已消毒器皿瓶口,、瓶塞內(nèi)部,，吸管前部等所有可能與細(xì)胞接觸的部分，如已接觸,，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。
10.開啟,、關(guān)閉長有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時(shí),，火焰滅菌時(shí)間要短。防止因溫度過高燒死細(xì)胞,。
11.換液時(shí)傾倒廢液,，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過快,，防止廢液四濺,。
12.吹打細(xì)胞時(shí)，要注意邊角的細(xì)胞是否吹打下來,。
13.手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上,，即不可以在開放容器上方操作。
14.每次操作只處理一株細(xì)胞,，以免造成細(xì)胞交叉污染,。
16.從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但為對數(shù)生長期細(xì)胞,。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液,。
