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細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

2013-6-16　　閱讀(1416)

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一,、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/a>

1,、掌屋凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征
　　2、學(xué)會(huì)用熒光探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記來檢測正?；罴?xì)胞,、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的方法

二、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞死亡根據(jù)其性質(zhì),、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型,。凋亡普遍存在于生命界，在生物個(gè)體和生存中起著非常重要的作用,。它是細(xì)胞在一定生理?xiàng)l件下一系列順序發(fā)生事件的組合,，是細(xì)胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細(xì)胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征,。

在形態(tài)上可見凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離接觸,，細(xì)胞變園，細(xì)胞膜向內(nèi)皺縮,、胞漿濃縮,、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞核固縮破裂呈團(tuán)塊狀或新月狀分布,、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜進(jìn)一步融合將細(xì)胞分成多個(gè)完整包裹的凋亡小體,，凋亡小體zui后被吞噬細(xì)胞吞噬消化。在凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)容物并不釋放到細(xì)胞外,，不會(huì)影響其它細(xì)胞,，因而不引起炎癥反應(yīng)。

在生物化學(xué)上,，多數(shù)細(xì)胞凋亡的過程中,，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化，活性增加。核DNA隨機(jī)地在核小體的連接部位被酶切斷,，降解為180-200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷,。如果對(duì)核DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數(shù)的DNA ladder（梯狀帶紋）的特征,。

相比之下，壞死是細(xì)胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細(xì)胞死亡,。細(xì)胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性,，各種細(xì)胞器膨脹，進(jìn)而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內(nèi)容物,，引起炎癥反應(yīng),，壞死過程中細(xì)胞核DNA雖也降解，但由于存在各種長度不等的DNA斷,，不能形成梯狀帶紋,，而呈彌散狀。

一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,，通常這些因素在誘導(dǎo)凋亡的同時(shí),，也可產(chǎn)生細(xì)胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細(xì)胞本身對(duì)刺激的敏感程度,。

三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對(duì)急性粒細(xì)胞白血病,，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時(shí),，即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡,，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。本實(shí)驗(yàn)用1μg/ml HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡,，同時(shí)也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死,。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色,，可以區(qū)別凋亡,、壞死及正常細(xì)胞。

細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜,，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜,。當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí)，質(zhì)膜不完整,，PI就進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細(xì)胞著色,，凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞不著色,。而一些活細(xì)胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞，因而可進(jìn)行活細(xì)胞染色,。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱,，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合（主要結(jié)合于A-T）堿基區(qū)）,，顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞,。凡是看到有凋亡小體的細(xì)胞都是凋亡細(xì)胞。

三,、實(shí)驗(yàn)用品

1,、試劑：三尖杉酯堿（HT），300μg/ml,，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5）,，5mol/L EDTA緩沖液、堿性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS,、醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）,；異丙醇；70%乙醇,；溴酚藍(lán),，蔗糖指示劑。TBE電泳緩沖液,，1%瓊脂糖,，溴乙錠。PI母液：500μg/ml,；Ho33342母液：2mmol/L,。
　　2、儀器設(shè)備：熒光顯微鏡,，電泳儀,，電泳槽，微量加樣器（1ml,，100μl）0.5,、1.5ml離心管，載玻片,，蓋玻片,。

四、實(shí)驗(yàn)材料

人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞,，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃,，5%CO2條件下培養(yǎng)。

五,、方法步驟

1,、三尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細(xì)胞凋亡
　?。?）實(shí)驗(yàn)前約24小時(shí)，接種兩瓶HL-60細(xì)胞,，標(biāo)記①,、②，每瓶含約6ml培養(yǎng)液,，置37℃,，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
　?。?）實(shí)驗(yàn)前約2.5小時(shí),，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%，①號(hào)瓶加入三尖杉酯堿200μl,，使終濃度為1μg/ml，②號(hào)瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作對(duì)照,。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時(shí),。

2、Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細(xì)胞
　?。?）染色：將瓶中的細(xì)胞搖勻取200μl于1.5ml的離心管中,，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl,，染色15分鐘,。
　　（2）滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室,，從離心管中各取以上染色后的細(xì)胞懸液10μl,，加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光,，高倍鏡下觀察,，區(qū)別三種細(xì)胞，并注意三者比例,。

六,、注意事項(xiàng)

1、誘導(dǎo)培養(yǎng)HL-60細(xì)胞時(shí)間要準(zhǔn)確,；
　　2,、熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，由于熒光易碎滅,，觀察時(shí)要盡量快

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