聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機(jī)：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號(hào)中華門大廈18樓D座
- 個(gè)性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/span>
通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞的技術(shù)以及篩選轉(zhuǎn)化體的技術(shù),。了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。
2. 相關(guān)知識(shí)及原理
感受態(tài)細(xì)胞（Competent cells）：
受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2,，RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后,，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞（competent cell） ,。
轉(zhuǎn)化（transformation）：
是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系,，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù),。
進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制表達(dá),，才能實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀,。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制－修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。
轉(zhuǎn)化的方法：
化學(xué)的方法（熱擊法）：使用化學(xué)試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細(xì)胞,，通過熱擊處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞,；
電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞,，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。
克隆的篩選：
主要用不同抗生素基因篩選,。常用的抗生素有：氨芐青霉素,、卡那霉素、氯霉素,、四環(huán)素,、鏈霉素等；將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng),，才能較容易地篩選出轉(zhuǎn)化體,，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。否則,，如果將轉(zhuǎn)化后的菌液涂在無(wú)選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上,，會(huì)出現(xiàn)成千上萬(wàn)的細(xì)菌菌落，將難以確認(rèn)哪一個(gè)克隆含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒,。雖然只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)菌才能在含有抗生素的平板上生長(zhǎng)和繁殖,，但對(duì)于連接混合物而言，此時(shí)并不能確定哪個(gè)克隆含有插入片段,。
重組質(zhì)?？寺〉蔫b定
鑒定帶有重組質(zhì)粒克隆的方法常用的有a- 互補(bǔ),、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析,、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法,。zui常用的方法是小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析,，對(duì)于帶有LacZ基因的載體還可以結(jié)合a-互補(bǔ)現(xiàn)象來(lái)篩選。
a-互補(bǔ)現(xiàn)象：
因?yàn)樵S多載體都帶有一個(gè)LacZ基因的調(diào)控序列和頭146個(gè)氨基酸的編碼信息,，編碼a-互補(bǔ)肽,，該肽段能與宿主編碼的缺陷型a-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)（a-互補(bǔ)）,。當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞中時(shí),，在異丙基β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，宿主可同時(shí)合成這兩種肽段,，雖然它們各自都沒有酶活性,，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。所以稱這種現(xiàn)象為a-互補(bǔ)現(xiàn)象,。
由互補(bǔ)產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶（LacZ）能夠作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－b－D－半乳糖苷（X-gal）而產(chǎn)生藍(lán)色的菌落,，所以利用這個(gè)特點(diǎn)，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個(gè)多克隆位點(diǎn),，當(dāng)插入一個(gè)外源DNA段時(shí),，會(huì)造成LacZ（a-）基因的失活,，破壞a-互補(bǔ)作用，就不能產(chǎn)生具有活性的酶,。所以,，有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒有重組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色,。
3．儀器,、材料和試劑
無(wú)菌超凈臺(tái)，電熱恒溫水浴,，分光光度計(jì),，離心機(jī)，移液器,，微型離心管等,；
菌株：E.coli DH5α
質(zhì)粒：pBluscript KS+DNA 片段的質(zhì)粒以及 pBluscript KS 空質(zhì)粒；
LB培養(yǎng)基,；含抗菌素的LB平板培養(yǎng)基（氨芐青霉素,，濃度50-100µg／mL，X-gal 20-48µg/ml, IPTG 100 µg/ml,。一般將抗生素,、X-gal和IPTG配制成1000µl儲(chǔ)備液，用時(shí)按培養(yǎng)基的量再加入）,；預(yù)冷CaCl2溶液（0.1mol／L）
．操作步驟
1）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl2法）
（1） 從新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一單菌落,，接種于3～5ml LB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)12h左右,，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,。將該菌懸液以1:100～1:50轉(zhuǎn)接于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng),，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后,，每隔20～30min測(cè)一次OD600nm，至OD600nm≤0.5時(shí)停止培養(yǎng),；
（2） 每組取培養(yǎng)液3個(gè)2ml轉(zhuǎn)入2ml離心管中,，在冰上冷卻20-30min，于4℃,，4000r／min離心10min（從這一步開始,，所有操作均在冰上進(jìn)行，速度盡量快而穩(wěn)）,；
（3） 倒凈上清培養(yǎng)液,，用1ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴,；
（4） 0～4℃,，4000r／min離心10min；
（5） 棄去上清液,，加入500µll冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液,，小心懸浮細(xì)胞。0～4℃,，4000r／min離心10min,；
（6） 棄去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液,，小心懸浮細(xì)胞,，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液,；
（7） 制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),，也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中,，置于-70℃條件下,，可保存半年至一年。
（1） 從新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一單菌落,，接種于3～5ml LB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)12h左右,，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,。將該菌懸液以1:100～1:50轉(zhuǎn)接于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng),，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后,，每隔20～30min測(cè)一次OD600nm，至OD600nm≤0.5時(shí)停止培養(yǎng),；
（2） 每組取培養(yǎng)液3個(gè)2ml轉(zhuǎn)入2ml離心管中,，在冰上冷卻20-30min，于4℃,，4000r／min離心10min（從這一步開始,，所有操作均在冰上進(jìn)行，速度盡量快而穩(wěn)）,；
（3） 倒凈上清培養(yǎng)液,，用1ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴,；
（4） 0～4℃,，4000r／min離心10min；
（5） 棄去上清液,，加入500µll冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液,，小心懸浮細(xì)胞。0～4℃,，4000r／min離心10min,；
（6） 棄去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液,，小心懸浮細(xì)胞,，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液,；
（7） 制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),，也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中,，置于-70℃條件下,，可保存半年至一年。
2）細(xì)胞轉(zhuǎn)化
（1） 分別取3個(gè)100µl感受態(tài)細(xì)胞懸液（如是冷凍保存液,，則需化凍后馬上進(jìn)行下面的操作）,，*組，加入10 µl重組質(zhì)粒DNA（體積不超過10µl） 100µl感受態(tài)細(xì)胞,，此管為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組,。第二組，插入DNA段對(duì)照組,，即酶切后DNA段25ng 100µl感受態(tài)細(xì)胞懸液,；第三組，質(zhì)粒DNA對(duì)照組,，即1ng 未酶切pBluescript 質(zhì)粒DNA十100µl感受態(tài)細(xì)胞懸液,。
（2） 將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置20-30min,，于42℃水浴中保溫1－2min,，然后迅速冰上冷卻2min
（3） 立即向上述管中分別加入0.4ml LB液體培養(yǎng)基（不需在冰上操作），使總體積到0.5ml,，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液,，搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約45-60min ,，使受體菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因產(chǎn)物（Ampr）。
（1） 分別取3個(gè)100µl感受態(tài)細(xì)胞懸液（如是冷凍保存液,，則需化凍后馬上進(jìn)行下面的操作）,，*組，加入10 µl重組質(zhì)粒DNA（體積不超過10µl） 100µl感受態(tài)細(xì)胞,，此管為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組,。第二組，插入DNA段對(duì)照組,，即酶切后DNA段25ng 100µl感受態(tài)細(xì)胞懸液,；第三組，質(zhì)粒DNA對(duì)照組,，即1ng 未酶切pBluescript 質(zhì)粒DNA十100µl感受態(tài)細(xì)胞懸液,。
（2） 將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置20-30min,，于42℃水浴中保溫1－2min,，然后迅速冰上冷卻2min
（3） 立即向上述管中分別加入0.4ml LB液體培養(yǎng)基（不需在冰上操作），使總體積到0.5ml,，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液,，搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約45-60min ,，使受體菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因產(chǎn)物（Ampr）。
3） 平板培養(yǎng)（有時(shí)需要稀釋）
（1） 取各樣品培養(yǎng)液0.1ml，分別接種于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上,，涂勻（如果用玻璃棒涂抹,，酒精燈燒過后稍微涼一下再用，不要過燙）,。
（2） 菌液*被培養(yǎng)基吸收后,，倒置培養(yǎng)皿，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜（12-16小時(shí)）,，待菌落生長(zhǎng)良好而又未互相重疊時(shí)停止培養(yǎng),，對(duì)于可以藍(lán)白斑篩選的質(zhì)粒和菌株來(lái)說(shuō)，此時(shí)應(yīng)該能清楚地看到藍(lán)色和白色菌落,。
（1） 取各樣品培養(yǎng)液0.1ml，分別接種于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上,，涂勻（如果用玻璃棒涂抹,，酒精燈燒過后稍微涼一下再用，不要過燙）,。
（2） 菌液*被培養(yǎng)基吸收后,，倒置培養(yǎng)皿，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜（12-16小時(shí)）,，待菌落生長(zhǎng)良好而又未互相重疊時(shí)停止培養(yǎng),，對(duì)于可以藍(lán)白斑篩選的質(zhì)粒和菌株來(lái)說(shuō)，此時(shí)應(yīng)該能清楚地看到藍(lán)色和白色菌落,。
用 CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞,，可使每微克超螺旋質(zhì)粒 DNA產(chǎn)生5×106-2×107個(gè)轉(zhuǎn)化菌落。在實(shí)際工作中,，每微克有105以上的轉(zhuǎn)化菌落足以滿足一般的克隆實(shí)驗(yàn),。
4） 檢出轉(zhuǎn)化體和計(jì)算轉(zhuǎn)化率
統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長(zhǎng)狀況應(yīng)如表所示：
各實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長(zhǎng)狀況及結(jié)果分析
統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長(zhǎng)狀況應(yīng)如表所示：
各實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長(zhǎng)狀況及結(jié)果分析
轉(zhuǎn)化體總數(shù)＝菌落數(shù)×（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積）
插入頻率＝藍(lán)色菌落數(shù)/白色菌落數(shù)
轉(zhuǎn)化頻率＝轉(zhuǎn)化體總數(shù)/加入質(zhì)粒DNA的量（計(jì)算出每微克的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)）
插入頻率＝藍(lán)色菌落數(shù)/白色菌落數(shù)
轉(zhuǎn)化頻率＝轉(zhuǎn)化體總數(shù)/加入質(zhì)粒DNA的量（計(jì)算出每微克的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)）
