產(chǎn) 地：諾博萊德科技
對應(yīng)進(jìn)口產(chǎn)品：Ni Sepharose High Performance
產(chǎn) 地：國產(chǎn)
性 狀：凝膠狀,，保存在20%酒精溶液中
凝膠類型：小配體親和色譜填料
結(jié)構(gòu)成分：6%交聯(lián)瓊脂糖
平均粒徑：34µm
配基基團(tuán)：Ni2+
配體密度：15μmol/ml
工作PH值：3-12
操作溫度：4-30℃
保存條件：4℃

產(chǎn)品名稱：鎳-瓊脂糖凝膠 HP

產(chǎn)    地：諾博萊德科技

對應(yīng)進(jìn)口產(chǎn)品：Ni Sepharose High Performance

產(chǎn)    地：國產(chǎn)

性    狀：凝膠狀,，保存在20%酒精溶液中

凝膠類型：小配體親和色譜填料

結(jié)構(gòu)成分：6%交聯(lián)瓊脂糖

平均粒徑：34µm

配基基團(tuán)：Ni²⁺ 

配體密度：15μmol/ml

工作PH值：3-12

操作溫度：4-30℃

保存條件：4℃

應(yīng)    用：分離帶His標(biāo)簽的重組蛋白及能被金屬離子吸附的多肽,、蛋白,、核苷酸,、磷酸化蛋白,，高分辨率,。

 

產(chǎn)品說明：

Ni-瓊脂糖凝膠H.P.是用于純化6×His標(biāo)簽重組蛋白的一種純化介質(zhì),，它是由6%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得. 它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的6×His標(biāo)簽重組蛋白,。NTA,，含有四個螯合區(qū)，較一般的三齒螯合劑能更好的結(jié)合Ni2+,。6×His可與Ni2+螯合,，從而使His標(biāo)簽蛋白結(jié)合在Ni-NTA純化介質(zhì)上，未結(jié)合的蛋白被洗滌下去,，結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)過一定濃度的咪唑或低pH緩沖液的溫和洗脫下來,，從而得到高純度的目的蛋白。該純化介質(zhì)與His標(biāo)簽蛋白具有*的親和力,，可達(dá)5-20 mg/mL,。可在非變性和變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)所得的His標(biāo)簽蛋白,。純化程序簡單,，所得的蛋白純度可高達(dá)95%。Ni-NTA可再生4-6次,，重復(fù)使用,。本產(chǎn)品懸浮液為20%乙醇，已螯合Ni2+,。

操作方法：

A. 非變性條件下抽提His標(biāo)簽蛋白

1) 準(zhǔn)備細(xì)胞,，接種，誘導(dǎo)表達(dá),。收集細(xì)胞,，置于-70°C或立即進(jìn)行步驟2操作。

2) 加入1/20細(xì)胞生長體積的NTA-0 Buffer和PMSF,。PMSF使用的工作濃度為1 mM現(xiàn)用現(xiàn)加,。

3) 將細(xì)胞懸浮起來，加入溶菌酶,，混勻,，冰上放置30分鐘，超聲或勻漿破碎細(xì)胞,。該步驟冰上操作,。

4) 加入10% Triton X-100, 使終濃度為0.05%，充分混勻，冰上放置15分鐘,。

5) 12000 rpm/min(20,000×g以上),，4°C離心15分鐘以上。取上清,，置于冰上備用或-20°C保存,。

6) 將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗,。

7) 將樣品加至NTA層析柱中,，流速在15 mL/h左右，收集穿透部分,，用SDS/PAGE分析蛋白的結(jié)合情況,。

8) 層析用5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30 mL/h左右,。

9) 分別用5倍NTA體積的NTA-20,、NTA-40、NTA-60,、NTA-80,、NTA-100、NTA-200,、NTA-1000 Buffer洗脫,，流速控制在15 mL/h左右，收集洗脫液,，每管收集一個NTA體積,。

10) 確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。為有效的方式是SDS-PAGE分析,。也可以用Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒,，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布,。

11)純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)的保存條件需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定,。 NTA-0,、20,、40、60,、80,、100、200,、1000Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,，添加0、20、40,、60,、80、100,、200,、1000 mM Imidazole。

B.變性條件下從包涵體中純化His標(biāo)簽蛋白

1) 準(zhǔn)備細(xì)胞,，接種,，誘導(dǎo)表達(dá)。收集細(xì)胞,，置于-70°C或立即進(jìn)行步驟2操作,。

2) 加入1/20細(xì)胞生長體積的GuNTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1 mM現(xiàn)用現(xiàn)加,。

3) 將細(xì)胞懸浮起來,，冰上超聲破碎細(xì)胞，降低粘稠度,。

4) 室溫放置30分鐘,，間或混勻或用磁力攪拌。

5) 12000轉(zhuǎn)/分（20,000×g以上）,，4°C離心15分鐘以上,。取上清，置于冰上備用或-20°C保存,。

6) 將NTA樹脂裝入合適的層析柱,，層析用10倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加到NTA層析柱中,，流速控制在15 mL/h左右,，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況,。

8) 層析用5倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗,，流速控制在30 mL/h左右。

9) 分別用5倍NTA體積GuNTA-20,、GuNTA-40,，GuNTA-60、GuNTA-100,、GuNTA-500洗脫,，流速在15 mL/ h左右，收集洗脫液,，每管收集一個NTA體積,。

10) 確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況,。為有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒,，快速確定蛋白質(zhì)的含量,，然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。

11) 目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定,。 12) 純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)需要復(fù)性,，復(fù)性常用的手段可以參考有關(guān)手冊確定的原則。

GuNTA-0 ,、20,、40、60,、100,、500Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M Guanidium HCl添加0、20,、40,、60、100,、500 mM Imidazole,。

C. NTA樹脂的再生 NTA樹脂在使用若干次數(shù)（3-5次）后，結(jié)合效率有所下降,，可以用以下方法再生,，提高樹脂的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液,，估計出NTA的樹脂體積,，按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋铮诘壬弦徊皆偕芤毫鞲珊?，再加下一步再生溶解,。用戶需要自行?zhǔn)備25%、50%,、75%,、99.99%（v/v）乙醇和去離子水。 從層析柱下端流干所有溶液,，用2倍NTA樹脂體積的Stripping Solution I,、2倍體積的去離子水、3倍體積的Stripping Solution II,、1倍體積的25%乙醇,、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的75%乙醇,、5倍體積的99.99%乙醇,、1倍體積的75%乙醇、1倍體積的50%乙醇,、1倍體積的25%乙醇,、1倍體積的去離子水、5倍體積的Stripping Solution III,、3倍體積的去離子水分別洗一遍,。 如果立即使用，用5倍體積的Ni Charging Solution洗,，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗,；如果想長期儲存，加入1倍體積的20%乙醇,，4°C保存,，使用前用5倍體積的Ni Charging Solution洗，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗

再生溶液配方：Stripping Solution I:  6M GuHCl, 0.2M acetic acid,。Stripping Solution II: 2% SDS,。        Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4