谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B C10H17N3O6S
特性: 粒度：45-165µm 流速：75cm/h 工作PH：4-10 耐壓：0.3Mpa 載量：＞5mg 谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶

谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B C10H17N3O6S 

pGEX載體表達的外源蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合，因此可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進行純化,。GSTs是一類以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作為底物,，通過形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶,。由于GST對底物的親和力是亞毫摩爾級的,，因此谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對GST及其融合蛋白的純化效率很高,?？梢杂煤坞x谷胱甘肽的緩沖液洗脫結(jié)合GST融合蛋白,。樹脂用3mol/L NaCl的緩沖液再生。谷胱甘肽瓊脂糖對GST融合蛋白的結(jié)合能力很強（每毫升柱床體積的樹脂能結(jié)合8毫克融合蛋白）,。

特性:    粒度：45-165µm                        流速：75cm/h               工作PH：4-10                        耐壓：0.3Mpa    載量：＞5mg 谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶

使用說明：

谷胱甘肽樹脂的處理:

1.輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器,，將樹脂混成勻漿。

2.取部分勻漿放入15mL聚丙烯管（每100mL 細菌培養(yǎng)物大約需要2mL 勻漿）,。

3.4℃ 500 g離心5分鐘,，小心去掉上清。

4.在樹脂中加入10倍柱床體積預(yù)冷的PBS,，顛倒數(shù)次混勻,，4℃ 500 g離心5分鐘，小心去掉上清,。

5.每毫升樹脂加入1毫升冷的PBS，制成50%勻漿,，顛倒數(shù)次,，混合均勻，懸液冰上放置待用,。制備細胞抽提物：

6.每100毫升培養(yǎng)物的細胞沉淀重懸于4mL PBS緩沖液中,。

7.加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL,冰上放置30分鐘。

8.用針筒將10mL 濃度為0.2%的TritonX-100 強行注入黏稠的細胞裂解物中,，劇烈振動數(shù)次混勻,。加入DNase和RNase至終濃度5ug/mL, 4℃振動溫育10分鐘,，4℃ 3000 g離心30分鐘，去除不溶性細胞碎片,，上清轉(zhuǎn)移到一只新管中,，加入DTT至終濃度1mmol/L。純化融合蛋白：

9.細胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混和,，每100毫升細菌培養(yǎng)物加2mL樹脂,，于室溫輕搖30min。

10.混合物于4℃以500 g離心5分鐘,，小心去掉上清并留樣少許進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,。

11.沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒離心管數(shù)次混勻,，洗去未與樹脂結(jié)合的蛋白,。

12.4℃以500 g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,。

13.重復(fù)步驟11和12兩次,。

14.結(jié)合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫，也可用凝血酶,、腸激酶或Xa 因子切割,，釋放靶蛋白。

用谷胱甘肽洗脫融合蛋白：

15.沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液,，室溫輕輕攪動10min,，洗脫樹脂上結(jié)合的蛋白。

16.4℃以500 g離心5分鐘,，上清（含洗脫的融合蛋白）移至新管中,。

17.重復(fù)步驟a和b兩次，合并3次上清,。蛋白酶解從結(jié)合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：

18.在結(jié)合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶,、腸激酶或Xa 因子（根據(jù)融合蛋白中的位點選擇），每mL樹脂加入50單位溶于1mLPBS的蛋白酶,。顛倒離心管數(shù)次混勻,，室溫下振蕩2—16小時。用小規(guī)模實驗確定精確時間,。

19.4℃以500 g離心5分鐘,，上清小心移至新管中。（GST仍結(jié)合在樹脂上,，而靶蛋白在上清中,，蛋白酶也在上清中，仍需要分離）

20.10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質(zhì)組成,。試劑配制：谷胱甘肽洗脫緩沖液：10mmol/L還原型谷胱甘肽,，50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)