紫外可見分光光度計高分子結(jié)合物含量測定法
本法系利用高分子結(jié)合物,、低分子結(jié)合物及游離多糖
在不同乙醇濃度下，沉淀分離,，采用紫外-可見分光光度
法測定磷含量,，計算高分子結(jié)合物的含暈。‘
試劑 （1) 5mol/L氯化鈉溶液精密稱定氯化鈉
29.22g,，加水溶解并稀釋至100ml,，室溫保存。
(2) 1.5mol/L硫酸于1體積9 8 %的硫酸中加入11
體積的水,，混勻,。
(3) 2. 5 % 鉬酸銨稱取鉬酸銨2.65g，加水溶解并
稀釋至100ml,。
(4) 1 0 %抗壞血酸稱取抗壞血酸10g,，加水溶解并
稀釋至100ml。
( 5 )礦化試劑硫酸與7 0 %髙氯酸等體積混合制得,。
( 6 )產(chǎn)色試劑水,、1.5mol/L硫酸、2. 5 % 鉬酸銨,、
1 0 %抗壞血酸,，按2 : 1 : 1 : 1體積比混合配制。
(7) 80Mg/ml磷對照品貯備液精密稱定經(jīng)100°C干燥
的磷酸氫二鈉0. 3665g或磷酸二氫鉀0. 3509g,加水500ml,、
5mol/L硫酸溶液10ml溶解,，補加水至1000ml。臨用時,，
將貯備液做20倍稀釋,，即為4Mg/ml磷對照品工作液。
(8) l.Otnol/L氫氧化鈉溶液稱取4 g氫氧化鈉,，加
水溶解并稀釋至100ml,。
供試品溶液的制備 （1) 分步沉淀原液用生理氯
化鈉溶液稀釋至多糖含量20?2 % g / m l或成品疫苗3ml,
加人5mol/L氯化鈉溶液0.75ml,，混勻后加人無水乙醇
1 5 m l ,于一20°C冰箱放置72?96小時，以每分鐘8000轉(zhuǎn)
4°C離心9 0分鐘,，吸取上清液為供試品溶液2 ; 于沉淀中
加人50,%乙醇溶液0.5ml,，加玻璃珠，混合后室溫放置1
小時,；再加人5 0 %乙醇溶液1.5ml,，混合后室溫放置2 小
時然后以每分鐘8000轉(zhuǎn)8°C離心1小時，吸取1.8ml上
清液為供試品溶液3 ; 沉淀再加人l.Omol/L氫氧化鈉溶
液0.5ml,，混合后室溫放置1小時,，加水1.25ml，作為供
試品溶液4,。
( 2 )取多糖含量20?的原液或成品疫苗
1.0ml為供試品1,。
( 3 )供試品溶液的礦化分別量取1.0ml供試品1、
1.5ml供試品溶液2,、0.7ml供試品溶液3,、0.5ml供試品
溶液4 各2 份；分別加人礦化試劑0. 15ml,，置150°C干燥
1小時,，然后升溫至180°C干燥3 0分鐘，再升溫至250°C
干燥1小時,。
測定法量取水1.95ml,，加礦化試劑50卩1后加
2.0ml產(chǎn)色試劑，混勻后置37°C水浴2 小時,，在波長
82 5 m n處測定吸光度,，作為空白對照。
于礦化好的供試品溶液中加水1.85ml,，加產(chǎn)色試劑
2.0ml,混勻后置37°C水浴2 小時,，在波長8 2 5 n m處測定
吸光度。
分別量取磷對照品工作液0.1ml,、0.2ml,、0.4ml、
0.8ml,、1.0ml于試管中,，每管依次加水1. 85ml、1.75ml,、
1.55ml、1.15ml,、0.95ml,；然后每管分別加人礦化試劑
50M1后加2.0ml產(chǎn)色試劑，混勻后置37°C水浴1 小時，
在波長82 5 n m處測定吸光度,。
結(jié)果計算以憐對照品溶液的濃度對其相應(yīng)的吸光度
作直線回歸,，求得直線回歸方程。將供試品溶液的吸光度
代人直線回歸方程,，求出磷含量,。
供試品磷含量（y g/ml)分別為：
p^CA.xsy/i.o
P 2 = (A2X18. 75)/1.5
P 3- ( A 3X2.0)/0. 7
P 4 = ( A 4 X2. 0)/0. 5-(P3X10)/100
試驗有效性 8 0 % < _ P 1A P 2+ P 3+ 尺）< 1 2 0 %
供試品高分子結(jié)合物含量（％) = 巧/(朽+ P 3+ h ) X
100
供試品游離多糖含量（％)=[1 — P 4/(朽+ P 3+ P 4 ) ] X
100
式中P ,、P 2,、P 3,、尸4 為供試品1，供試品溶液2,，
供試品溶液3,，供試品溶液4 的磷含量；A ,,、A 2,、A 3、
八4為供試品1,，供試品2,，供試品3，供試品4 中取樣礦
化后的磷含量,。
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