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紫外可見分光光度計(jì)高分子結(jié)合物含量測(cè)定法

本法系利用高分子結(jié)合物,、低分子結(jié)合物及游離多糖

在不同乙醇濃度下,，沉淀分離，采用紫外-可見分光光度

法測(cè)定磷含量,，計(jì)算高分子結(jié)合物的含暈,。‘

試劑 （1) 5mol/L氯化鈉溶液精密稱定氯化鈉

29.22g，加水溶解并稀釋至100ml,，室溫保存,。

(2) 1.5mol/L硫酸于1體積9 8 %的硫酸中加入11

體積的水，混勻,。

(3) 2. 5 % 鉬酸銨稱取鉬酸銨2.65g,，加水溶解并

稀釋至100ml。

(4) 1 0 %抗壞血酸稱取抗壞血酸10g,，加水溶解并

稀釋至100ml,。

( 5 )礦化試劑硫酸與7 0 %髙氯酸等體積混合制得。

( 6 )產(chǎn)色試劑水,、1.5mol/L硫酸,、2. 5 % 鉬酸銨、

1 0 %抗壞血酸,，按2 : 1 : 1 : 1體積比混合配制,。

(7) 80Mg/ml磷對(duì)照品貯備液精密稱定經(jīng)100°C干燥

的磷酸氫二鈉0. 3665g或磷酸二氫鉀0. 3509g,加水500ml、

5mol/L硫酸溶液10ml溶解,，補(bǔ)加水至1000ml,。臨用時(shí)，

將貯備液做20倍稀釋,，即為4Mg/ml磷對(duì)照品工作液,。

(8) l.Otnol/L氫氧化鈉溶液稱取4 g氫氧化鈉，加

水溶解并稀釋至100ml,。

供試品溶液的制備 （1) 分步沉淀原液用生理氯

化鈉溶液稀釋至多糖含量20?2 % g / m l或成品疫苗3ml,

加人5mol/L氯化鈉溶液0.75ml,，混勻后加人無水乙醇

1 5 m l ,于一20°C冰箱放置72?96小時(shí)，以每分鐘8000轉(zhuǎn)

4°C離心9 0分鐘,，吸取上清液為供試品溶液2 ; 于沉淀中

加人50,%乙醇溶液0.5ml,，加玻璃珠,，混合后室溫放置1

小時(shí)；再加人5 0 %乙醇溶液1.5ml,，混合后室溫放置2 小

時(shí)然后以每分鐘8000轉(zhuǎn)8°C離心1小時(shí)，吸取1.8ml上

清液為供試品溶液3 ; 沉淀再加人l.Omol/L氫氧化鈉溶

液0.5ml,，混合后室溫放置1小時(shí),，加水1.25ml，作為供

試品溶液4,。

( 2 )取多糖含量20?的原液或成品疫苗

1.0ml為供試品1,。

( 3 )供試品溶液的礦化分別量取1.0ml供試品1、

1.5ml供試品溶液2,、0.7ml供試品溶液3,、0.5ml供試品

溶液4 各2 份；分別加人礦化試劑0. 15ml,，置150°C干燥

1小時(shí),，然后升溫至180°C干燥3 0分鐘，再升溫至250°C

干燥1小時(shí),。

測(cè)定法量取水1.95ml,，加礦化試劑50卩1后加

2.0ml產(chǎn)色試劑，混勻后置37°C水浴2 小時(shí),，在波長(zhǎng)

82 5 m n處測(cè)定吸光度,，作為空白對(duì)照。

于礦化好的供試品溶液中加水1.85ml,，加產(chǎn)色試劑

2.0ml,混勻后置37°C水浴2 小時(shí),，在波長(zhǎng)8 2 5 n m處測(cè)定

吸光度。

分別量取磷對(duì)照品工作液0.1ml,、0.2ml,、0.4ml、

0.8ml,、1.0ml于試管中,，每管依次加水1. 85ml、1.75ml,、

1.55ml,、1.15ml、0.95ml,；然后每管分別加人礦化試劑

50M1后加2.0ml產(chǎn)色試劑,，混勻后置37°C水浴1 小時(shí)，

在波長(zhǎng)82 5 n m處測(cè)定吸光度,。

結(jié)果計(jì)算以憐對(duì)照品溶液的濃度對(duì)其相應(yīng)的吸光度

作直線回歸,，求得直線回歸方程,。將供試品溶液的吸光度

代人直線回歸方程，求出磷含量,。

供試品磷含量（y g/ml)分別為：

p^CA.xsy/i.o

P 2 = (A2X18. 75)/1.5

P 3- ( A 3X2.0)/0. 7

P 4 = ( A 4 X2. 0)/0. 5-(P3X10)/100

試驗(yàn)有效性 8 0 % < _ P 1A P 2+ P 3+ 尺）< 1 2 0 %

供試品高分子結(jié)合物含量（％) = 巧/(朽+ P 3+ h ) X

100

供試品游離多糖含量（％)=[1 — P 4/(朽+ P 3+ P 4 ) ] X

100

式中P ,,、P 2、P 3,、尸4 為供試品1,，供試品溶液2，

供試品溶液3,，供試品溶液4 的磷含量,；A ,、A 2,、A 3,、

八4為供試品1，供試品2,，供試品3,，供試品4 中取樣礦

化后的磷含量。