阿奇霉素

快速檢測試劑盒說明書

一,、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原,，樣本中的殘留物阿奇霉素將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗阿奇霉素抗體，加入酶標記物后,，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物阿奇霉素的含量成負相關,，與標準曲線比較即可得出相應殘留物阿奇霉素的含量,。

u 二、試劑盒特性

u 產(chǎn)品貨號：       YJ63A\J1

u 靈 敏 度：       0.05ppb

u 孵育溫度：       25℃

u 孵育時間：       30min～15min

u 樣本檢測下限

組   織     ······································· 0.5ppb

雞   蛋     ······································· 0.5ppb

牛   奶     ······································· 0.5ppb

u 交叉反應率

阿奇霉素（Azithromycin） ···················· 100%

紅霉素（Erythromycin） ···················· <1%

泰勒菌素（Tylosin） ···························· 30%

替米考星（Tilmicosin） ························ 23%

u 樣本回收率

組   織  ·································  70%~120%

三,、試劑盒組成

四、所用儀器,、試劑

具備的儀器：酶標儀,、均質器、振蕩器,、離心機,、刻度移液管、天平（感量0.01g）,、恒溫箱,、打印機

微量移液器：單道 20～200µl,、單道100～1000µl、多道30～300 µl

試      劑：氫氧化鈉,、甲醇

五,、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭,。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果,。

u 樣本前處理需配制：

配液1  提取液A

        1份20X提取液A+ 19份去離子水混合,。

配液2  提取液B

        1份2X提取液B+ 1份去離子水混合。

配液3  1M  NaOH溶液

        稱取4g氫氧化鈉固體加去離子水定容至100ML,。

配液4  10%甲醇

        1份無水甲醇+ 9份去離子水混合

u 樣本處理： 

（a）組織樣本的處理方法

1,、 稱2±0.05g均質后的組織至50ml離心管中，加入3ml提取液A,，渦旋振蕩3min,；

2、再加入600µl 1M  NaOH溶液和2.4ml 提取液B,，渦旋振蕩3min,；室溫4000r/min以上離心5min；

3,、取50 µl上層液體用于分析,。（注：離心后若有脂肪層，去除脂肪層或撥開脂肪層,，取清澈液體進行分析）,。

樣本稀釋倍數(shù)：  4倍

此方法為多合一（組合Ⅱ）處理方法，樣本可合一處理,。

（b）組織（雞肉,、鴨肉）、雞蛋,、牛奶樣本處理方法

1,、 稱取均質后的新鮮樣本1±0.05g于50ml離心管中，加入5ml 10%甲醇,，振蕩3min,，室溫4000r/min以上離心5min；

2,、 取50 µl上清用于分析,。

樣本稀釋倍數(shù):  5倍 

六、 酶標免疫分析程序:

u 測定前應須知：

1,、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）,。

2,、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。

3,、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點,。

4,、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射,，用蓋板膜蓋住微孔板,。

u 操作步驟：

1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,，室溫（20-25℃）平衡30min以上,，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2,、 取出框架及需要數(shù)量的微孔,，將不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃,。

3,、 配液：洗滌液配制

將15ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水

按照1:19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子

水），或按所需用量配制洗滌液,。

4,、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行,，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置,。

5、 加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中,，然后加酶標記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液,，用蓋板膜蓋板,，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境反應30min,。

6,、 將孔內液體甩干，用洗滌液250µl/孔洗板4～5次,，每次間隔15-～30秒,，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7,、 顯色：加入底物A液50µl/孔,，再加入底物B液50µl/孔,，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min,。

8,、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻,，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,，5min內讀數(shù)），測定每孔OD值,。

七,、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法,，定量判定用第2種方法,。注意樣本吸光度值與其所含阿奇霉素量成負相關。

1,、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml),。假設樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0,，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243,； 0.05ppb為1.816；0.15ppb為1.415,；0.45ppb為0.74,；1.35ppb為0.313；4.05ppb為0.155,。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb～4.05ppb,；樣本2的濃度范圍是0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中阿奇霉素實際濃度,。

2,、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值,，再乘以100%,，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以阿奇霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標,，繪制標準曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中阿奇霉素實際濃度,。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確,、快速分析,。（歡迎來電索?。?/span>

八、 注意事項

1,、 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低,。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會伴隨著標準曲線不成線性,，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作,。

3,、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象,。

4,、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚,。

5,、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度,、OD值變化,；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6,、 不用的微孔板放進自封袋重新密封,；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下,。

7,、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之,。標準品1的吸光度值小于0.5時,，表示試劑可能變質。

8,、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃,，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九,、儲藏條件和保質期

1、 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存,，不要冷凍,。

2、 保 質 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒,。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣,，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果,，請放心使用,。

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