β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性檢測試劑盒說明書

注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。

貨號：100T/48S

產品內容：

提取液：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存,。

微量法

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存,；臨用前每瓶加入 2.5mL 雙蒸水,，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存,。

試劑二：液體 4mL×1 瓶,，4℃保存。試劑三：液體 15mL×1 瓶,，4℃保存,。

標準液：液體 1mL×1 支，4℃保存,，5μmol/mL 對硝基苯酚溶液,。

產品說明：

β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞中,，能夠催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷鍵水解,，此外還具有轉半乳糖苷的作用。β-GAL不僅可為植物的快速生長釋放儲存的能量,，還能在正常的多糖代謝,、細胞壁組分代謝以及衰老時細胞壁降解過程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解,，釋放自由的半乳糖,。

β-GAL 分解對-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰,，通過測定吸光值升高速率來計算β-GAL 活性,。

試驗中所需的儀器和試劑：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機,、水浴鍋,、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一,、粗酶液提?。?/p>

1、細菌或培養(yǎng)細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內,，離心后棄上清,；按照每 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率 20％,，超聲 3 秒，間隔 10 秒,，重復30 次）,，15000g，4℃,，離心 20 分鐘,，取上清，置冰上待測,。

2,、組織的處理：稱取約 0.2g 組織，加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿,；15000g,，4℃，離心 20 分鐘， 取上清,，置冰上待測,。

3、標準液的處理：用蒸餾水將標準液稀釋至 200,、100,、50、25,、12.5,、6.25、0nmol/mL.

二,、測定步驟：

1,、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 400nm,，蒸餾水調零,。

2、樣本測定,，（在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列試劑）：

試劑名稱（μL）測定管對照管標準管

試劑一25

蒸餾水25

試劑二3535

樣本1010

迅速混勻,，放入 37℃保溫 30min

標準液70

試劑三130130130

充分混勻,， 400nm 處測定吸光值 A,，計算ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設一個對照管,。三,、β-GAL 活性計算：

根據標準管的吸光度（x，減去濃度為 0 的標準管 OD 值）和濃度（y,，nmol/mL）建立標準曲線,，將△A 帶入標準曲線中，計算樣品生成的產物量（nmol/mL）,。

1.按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時產生 1nmol  對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位,。

β-GAL 活力(nmol/h /mg prot)=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=14×y÷Cpr 需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒,。

2.按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g  組織每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位,。

β-GAL 活力(nmol/h /g 鮮重)＝(y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=14×y ÷W

3.按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1  萬個細菌或細胞每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/h /104 cell)= (y×V 反總)÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.028×y

Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL,；V 反總：反應體系總體積，0.07mL,；V 樣：加入反應體系中樣本體積,，0.01mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL,；W：樣本質量,，g； 500：細胞或細菌總數,， 500 萬,；T：反應時間，0.5h,。

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