核仁組成區(qū)嗜銀-AGNOR染色實驗服務

一.核仁組成區(qū)嗜銀(AGNOR)染色簡介

核仁組成區(qū)(NORs)是染色體上的一個編碼核糖體RNA(rRNA)的片段，存在于DNA特異性環(huán)上,，凸向核仁,。在電鏡下,，核仁組成區(qū)為在電子致密區(qū)中的境界不清的淺染區(qū)域。在石蠟切片上,在核仁中見到的每一個點狀反應顆粒有可能代表多 個AgNOR位點,。核仁組成區(qū)嗜銀蛋白染色主要特點是操作簡便,、批量染色的較為經(jīng)濟, AgNOR位點的數(shù)量增加與細胞增殖性增加有關(guān)，對于良惡性腫瘤的鑒別具有一定的意義,。

二,、試劑配制

1. AgNOR染色液

甲液:明膠2 g溶于雙蒸水至99 ml,在60°C使之*溶解，再加入純甲酸1 ml搖勻待用,。

乙液: AgNO350 g溶解于雙蒸水中至100 ml, 4°C冰箱保存,。

2. AgNOR工作液

取甲液10 ml,乙液20 ml臨用前混合。

三,、染色步驟

1.切片脫蠟至水

2.雙蒸水洗2次

3.AgNOR工作液中(25°C) 浸染30分鐘(暗處進行) (鏡下觀察)

4.脫水,，透明，封固

5結(jié)果:油鏡觀察,，細胞核及胞質(zhì)背暴為淡黃色,，AgNOR呈棕黑色顆粒狀。

四,、樣本說明

1,、 石蠟切片

取材: 1.組織離體后需及時固定; 2.組織標本不宜過大、過厚,。

固定: 1.固定液: 10%福爾馬林(4%Paraformaldehyde) 或10%中性甲醛: 2.用量: -般固定液的量與組織體積比為

10:1~20:1; 3. 固定:適宜的固定時間,，主要根據(jù)材料的大小松密程度及固定液的穿透速度而定。

保存:切片經(jīng)60°C烤片3-5小時后,，可于常溫或4°C干燥保存,。

2.冰凍切片

取材:取材后需立即置于超低溫冰箱或液氮中保存。

固定:樣本冰凍切片后,，應立即放入甲醇,、acetone. 95%酒精,、 4%Paraformaldehyde等固定液中固定。

保存:固定好的切片自然風干,，密封后置于-80°C. -20°C保存,， 盡快用于后續(xù)實驗。

3.細胞塊石蠟切片

細胞量較多的樣品,，可離心分離所需細胞,，用中性甲醛固定后制作成瓊脂細胞塊，然后按照制作石蠟切片的操作流程進行切

片,。

4,、細胞爬片

在孔板里做的細胞爬片，爬片取出后,，用PBS洗滌2次(根據(jù)研究目的,，PBS洗滌可選擇不做)。用4%Paraformaldehyde49C固定15分鐘,，將表面液體吹干,，置于-20°C保存。若在短時間內(nèi)即開展實驗,可在加固定液后,，于4°C冰箱中放置一段時間,。

5.細胞涂片細胞涂片常用的固定液有95%酒精(常用)、酒精 Glacial acetic acid solution. Ethyl ether-酒精液和

Carney's液等,。

五,、注意事項

1.常用的固定液為中性甲醛和4%Paraformaldehyde, 能使大多數(shù)抗原保存良好，適用于免疫組織化學,。

2.病理實驗切片zui好是防脫片,，以免實驗過程中出現(xiàn)掉片。若客戶提供切片,，應告知切片有無防脫處理,。

3.骨組織、皮膚組織或脂肪含量較高的樣本,實驗過程中有較高的掉片幾率,。

4.客戶可提供組織塊(以10%福爾馬林,、4%Paraformaldehyde或10%中性甲醛固定， 如組織塊極小請事先說明) . 蠟塊

或切片(使用免疫組化切片,，以避免實驗過程中掉片)

5.待檢測蛋白的種屬,、實驗分組情況及實驗背景資料、其他具體要求等需事先說明,。

6.若客戶提供骨組織或鈣化程度較高的組織進行實驗,，需進行脫鈣處理,。

7.浸泡在固定液中的組織樣本,，在運輸中容器需密封,，防止破碎、滲漏,。

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