凋亡因子Caspase-389檢測實驗

Caspase3

Caspase是一個在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase3也稱CPP32, 是細胞凋亡過程中的一個關鍵酶,，可以剪切procaspase2.6. 7和9，并可以直接特異性剪切許多caspase底物,，包括PARP (poly(ADP-ribose) polymerase), ICAD (Inhibitor of caspase-activated Deoxyri- bonuclease), gelsolin和fodrin等,。 這些由caspase 3介導的蛋白剪切是細胞凋亡分子機制的重要組成部分,。caspase 3在細胞核凋亡過程中也起到了關鍵作用,，包括染色質(zhì)固

縮，DNA*^片段化等,。同時caspase 3對細胞起泡(Cell blebbing)也起到關鍵作用,。

檢測原理基于casepase 3可以催化底物AC-DEVD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA(-itroaniline),從而可以通過測定吸光度來檢測caspase 3的活性。pNA在405nm附近有強吸收,。參照黃色產(chǎn)物pNA制作的標準曲線,，可以作為定量caspase 3酶活性的標準品。

Caspase-8

Caspase 8通常以酶原的形式存在,，在細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導過程中被激活,，Caspase 8被認為是細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導過程中上游的caspase,在Fas-receptor和TNFR-1介導的細胞凋亡 過程中caspase 8被激活,形成一個由p18和p10組成的二聚體,，進一步激活下游的caspase 4, caspase 6。caspase 9和caspase 10,。本方法基于Caspase 8可以催化底物AC-IETD-pNA產(chǎn)生黃色的pNA (-nitraniline),從而可以通過測定吸光度來檢測Caspase 8的活性,。pNA在405nm附近有強吸收。 檢測樣本的405nm OD值參照pNA制作的標準曲線,，可以計算樣品的Caspase 8酶活性,。

Caspase-9

Caspase 9也稱ICE-LAP6或Mch6,是細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導過程中上游的caspase。線粒體釋放細胞色素c以后,，caspase 9可以和細胞色素c以及Apaf1形成復合物，同時被激活,。激活的caspase 9可以激活細胞凋的關鍵酶caspase 3,從而促進后續(xù)的細胞凋亡信號,。Caspase 9的激活可以通過磷酸化進行調(diào)控。

本方法基于Caspase 9可以催化底物Ac- LEHD -pNA產(chǎn)“生黃色的pNA (p-nitroaniline),從而可以通過測定吸光度來檢測

Caspase 9的活性,。pNA在405nm附近有強吸收,。檢測樣本的405nm OD值參照pNA制作的標準曲線，可以計算樣品的Caspase 9酶活性,。

Caspase1

Caspase2

Caspase4

Caspase6

凋亡因子Caspase 3/8/9檢測樣本準備:

1)細胞樣品:取1x107個細胞(約1個T25的培養(yǎng)瓶細胞量) , 600g 4°C離心5分鐘收集細胞,，小心吸除上清，PBS洗滌一次,。吸取上清后,，每管細胞樣品加入100u|裂解液重懸沉淀,冰浴裂解15分鐘。4°C 16,000g離心10-15分鐘,， 把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預冷的離心管中,。立即測定caspase 3的酶活性或-70°C保存樣品。同時可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度,，盡量使蛋白濃度達到1-3mg/ml.

2)組織樣品:約每10mg組織加入100ul裂解液,，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。然后把勻漿液轉(zhuǎn)移到1 .5ml)離心管中,，冰浴再裂解5分鐘,。4°C 16,000g離心10-15分鐘,，把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預冷的離心管中。立即測定caspase 3的酶活性或-70°C保存

樣品,。同時可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度,，盡量使蛋白濃度達到1-3mg/ml.

Caspase-3活性檢測標準曲線

實驗周期: 7-10個工作日內(nèi)完成，重復檢測優(yōu)惠,。

客戶注意事項

1.抗體:事先咨詢上海研謹生物,，明確抗體種屬以及是否有該抗體可使用。如無可由雙方協(xié)商而定,，客戶自己購買提供或我公司代購;

2.標本收集與保存:

①組織樣品:新鮮組織放入液氮或70度保存,組織不少于100mg (約綠豆大小) ;

②培養(yǎng)細胞:通過細胞計數(shù)取不少于000000個細胞于EP管,，加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑，混勻后保存于冰箱(-70°C,，避免反復凍融) ;

③血液細胞標本:以抗凝管保存血樣或以淋巴細胞分離液分離細胞后加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑,，保存(-70°C可長期保存，避免反復凍融)

④血清或細胞培養(yǎng)液標本:離心去掉雜質(zhì)后取上清入EP管,，保存(以上4°C可保存15-20天,，-70°C可長期保存，避免反復凍融)

3,、樣本運輸:可選以下任何的一種方式寄送標本

①組織樣本,、細胞樣本以干冰運輸或加入蛋白保護劑后加冰袋運輸;

②細胞樣本也可以直接快件寄送培養(yǎng)瓶(密封保證不污染，培養(yǎng)液不漏出,細胞不要長得太滿,，50%左右,灌滿培養(yǎng)液) ;

③血清或上清液直接加冰袋寄送(密封保證液體不漏出,，視路途遠近2-3天可到達)。

實驗代做服務：