沙丁胺醇

快速檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

一、原理

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,，樣本中的殘留物沙丁胺醇將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗沙丁胺醇抗體,，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色,，樣本吸光值與其所含殘留物沙丁胺醇的含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物沙丁胺醇的含量。

二,、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   0.1ppb
• 孵育溫度：       25℃
• 孵育時(shí)間：       30min～15min
• 樣本檢測(cè)下限

尿     樣        ······························· 0.1ppb

組 織（處理法一） ····························· 0.4ppb

組 織（處理法二） ····························· 0.1ppb

飼      料      ·······························  1ppb

• 交叉反應(yīng)率

沙丁胺醇（Salbutamol ）·······················  100%

特pu他林（Terbutalin）   ·····················  <1%

克倫特羅（Clenbuterol）  ·····················  <1%

萊克多巴胺（Ractopamine）············ ······· <0.1%

• 樣本回收率

尿     樣   ·······························  95%±17%

組     織   ·······························  75%±22%

飼     料   ·······························  80%±18%

三,、試劑盒組成

四,、所用儀器,、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器,、振蕩器,、離心機(jī)、刻度移液管,、天平（感量0.01g）,、氮吹儀、恒溫箱,、打印機(jī)

微量移液器：?jiǎn)蔚?/span> 20～200µl,、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：乙酸乙酯,、乙腈,、氫氧化鈉、濃鹽酸,、甲醇,、無(wú)水硫酸鈉、正己烷

五,、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔,，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。

• 樣本前處理需配制：

配液1  0.1M HCl 溶液

取0.86ml濃HCl加水定溶至100ml。

配液2  0.1M NaOH 溶液

稱取0.4g NaOH加水定溶至100ml。

配液3  乙腈-0.1M HCl 溶液

        V_乙腈：V_HCl =84：16,。

配液4  樣本提取液

        1份20×樣本提取液 + 19份去離子水混合均勻后用于組織樣本提取,。

• 樣本處理：

（a）尿樣本的處理方法

取20µl清亮尿樣直接測(cè)定（如果尿樣渾濁一定要過(guò)濾或4000r/min離心10min,，直至得到清亮尿樣）,，暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

樣本稀釋倍數(shù):  1倍

（b）組織樣本的處理方法一

• 稱2±0.05g均質(zhì)后的組織至50ml離心管中，加入6ml稀釋后的樣本提取液,，充分振蕩2min,，室溫4000r/min以上離心10min(注：若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心),；
• 取20µl上層液進(jìn)行分析,。 

樣本稀釋倍數(shù):  4倍 

（c）組織樣本的處理方法二

• 稱取 2 ± 0.05g 均質(zhì)后的組織于50ml離心管中，加入6ml乙腈-0.1MHCl,，振蕩2min,室溫4000r/min以上離心10min,；
• 取上清3ml，加入2ml 0.1M NaOH,，加入6ml乙酸乙酯,，振蕩1min，室溫4000r/min 以上離心10min,。取全部上清于50～60℃氮?dú)饬骰蚩諝饬鞔蹈桑?/span>
• 加入1ml稀釋后的樣本提取液溶解干燥后的殘留物,，混合30s；
• 取20 µl用于分析,。

樣本稀釋倍數(shù)：  1倍  

（d）飼料處理方法

• 稱1.0±0.05g研碎的飼料樣品于50ml離心管中,，加入10ml甲醇，再加入5g無(wú)水硫酸鈉,，充分振蕩2min,；15℃ 4000r/min以上離心10min；
• 吸出離心后的上清液1ml,，于50～60℃氮?dú)饬骰蚩諝饬鞔蹈?，?/span>1 ml稀釋后的樣本提取液溶解干燥后的殘留物,，再加入1ml正己烷混合30s ,；15℃ 4000r/min以上離心5min；去除上層有機(jī)相,；
• 取下層20 µl用于分析,。

樣本稀釋倍數(shù)：10     

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

• 測(cè)定前應(yīng)須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）,。
• 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃,。
• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性,，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
• 所有恒溫孵育過(guò)程,，避免光線照射,，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上,，注意每種液體試劑使用前均須搖勻,。
• 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋,，保存于2～8℃,。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液,。
• 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,。
• 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20µl/孔到各自的微孔中,，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入80µl/孔的抗體工作液,，用蓋板膜蓋板,，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境反應(yīng)30min,。
• 將孔內(nèi)液體甩干,，用稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒,，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。
• 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
• 測(cè)定：加入終止液50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，5min內(nèi)讀數(shù)）,，測(cè)定每孔OD值,。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法,，粗略判定可用第1種方法,，定量判定用第2種方法,。注意樣本吸光度值與其所含沙丁胺醇量成負(fù)相關(guān),。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml),。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,，樣本2的吸光度值為1.0,，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816,；0.3ppb為1.415；0.9ppb為0.74,；2.7ppb為0.313；8.1ppb為0.155,。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb,；樣本2的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb,，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中沙丁胺醇實(shí)際濃度,。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算,，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第yi個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值,，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),，以沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中沙丁胺醇實(shí)際濃度,。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析,。（索?。?/span>

八、 注意事項(xiàng)

• 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低,。
• 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
• 混合要均勻,，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。
• 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚,。
• 不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒,；稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值變化,；不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑,。
• 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感,，因此要避免直接暴露在光線下,。
• 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之,。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí),，表示試劑可能變質(zhì)。
• 該試劑盒jia反應(yīng)溫度為25℃,，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。

九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期

• 儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2～8℃保存,，不要冷凍,。
• 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒,。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，請(qǐng)放心使用,。

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