氨芐青霉素快速檢測試劑盒說明書
一,、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氨芐青霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氨芐青霉素抗體,，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色,，樣本吸光值與其所含殘留物氨芐青霉素的含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物氨芐青霉素的含量。
二,、試劑盒特性
試劑盒靈敏度： 0.1ppb
孵育溫度： 25℃
孵育時(shí)間： 30min～30min～15min
樣本檢測下限
組織,、蜂蜜、牛奶 2ppb
蜂蜜,、牛奶樣本因存在一定的干擾,，定量檢測下限為4ppb
交叉反應(yīng)率
氨芐青霉素 100%
青 霉 素 0.8%
鄰氯青霉素 0.2%
雙氯青霉素 0.1%
阿莫西林 0.1%
頭孢塞呋 0.1%
樣本回收率
組 織 75±19%
蜂蜜 、牛奶 70±17%
三,、試劑盒組成
1,、微量測試孔：每條8孔,，一板12條
2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶（1ml/瓶）： 0ppb,、0.1ppb,、0.3ppb、0.9ppb,、2.7ppb,、8.1ppb
3、酶標(biāo)記物 12ml 紅色帽
4,、抗體工作液 7ml 藍(lán)色帽
5,、底物A液 7ml 白色帽
6、底物B液 7ml 黑色帽
7,、終止液 7ml 黃色帽
8,、20X濃縮洗滌液 40ml 白色帽
9、5X濃縮復(fù)溶液 50ml 透明帽
四,、所用儀器,、試劑
具備的儀器：酶標(biāo)儀,、均質(zhì)器,、振蕩器、離心機(jī),、刻度移液管,、天平（感量0.01g）、氮吹儀,、刻度移液管
微量移液器：單道 20µl～200µl,、單道100µl～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：氫氧化鈉,、乙腈,、正己烷、亞硝基鐵氰化na,、硫酸鋅
五,、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭,。
（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
樣本前處理需配制：
配液1 C液（牛奶,、奶粉樣本）：
10.7g 亞硝基鐵氰化na加去離子水100ml溶解。
配液2 D液（牛奶,、奶粉樣本）：
28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解,。
配液3 0.1M NaOH溶液
0.4gNaOH加去離子水100ml溶解,。
配液4 乙腈-0.1M NaOH溶液
84ml乙腈16ml 0.1M NaOH混合均勻
配液5 樣本復(fù)溶液：
將5X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：4稀釋。
配液6 1M NaOH溶液
4g NaOH加去離子水100ml溶解
樣本處理：
（a）組織（雞,、鴨,、豬肉/豬肝、蝦,、魚)樣本處理方法
1,、稱取2±0.05g均質(zhì)后樣本于50ml離心管中，加入2ml 1M NaOH溶液,，渦旋2min,，再加入8ml乙腈振蕩5min，室溫4000r/min以上離心10min,；
2,、取出1ml上清液，在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥,；
3,、加入1 ml樣本復(fù)溶液溶解干燥殘留物，混合30s,；將溶解后的樣本液按1：3（50µl樣本液加150µl樣本復(fù)溶液）稀釋,，混合30s；
4,、取50 µl用于分析
樣本稀釋倍數(shù): 20倍
（b）蜂蜜處理方法
1,、準(zhǔn)確稱取1±0.05g蜂蜜樣本于離心管中，加入3ml 樣本復(fù)溶液,，振蕩混勻后靜置20min,；室溫4000r/min 以上離心10min；
2,、取上層液體用樣本復(fù)溶液按1：4（20µl樣本液+80µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋,，混合30s；
3,、取50µl用于分析
樣本稀釋倍數(shù): 20倍
（c） 牛奶樣本處理方法一
1,、取2ml鮮牛奶于5ml離心管，加入50µlC液混勻,；
2,、加入50 µl D液振蕩1min，10℃ 4000r/min以上離心10min,；
3,、取上層清亮液體用樣本復(fù)溶液按1： 19（20µl樣本液+380µl樣本復(fù)溶液）稀釋，混合30s,；
4,、取50µl用于分析,。
樣本稀釋倍數(shù)：20
注：如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程,。
（d）牛奶樣本處理方法二
1,、取2ml去除脂肪奶樣至離心管中；
2,、加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min,，15℃ 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液,，在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥,；
3、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后,，再加入1ml樣本復(fù)溶液混合30s,，離心去除正己烷相；
4,、取下層相用樣本復(fù)溶液按1：3 （50µl樣本液加150µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋,，混合30s；
5,、取50µl用于分析,。
樣本稀釋倍數(shù): 20倍
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
測定前應(yīng)須知：
1,、使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）,。
2、使用之后立即將所有試劑放回2～8℃,。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的*性,，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。
4,、所有恒溫孵育過程,，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板,。
操作步驟：
1,、從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上,，注意每種液體試劑使用前均須搖勻,。
2、取出框架及需要數(shù)量的微孔,，將不用的微孔放入自封袋,，保存于2-8℃,。
3、配液：將40ml 20X濃縮洗滌液用去離子水稀釋至800ml,。
4,、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,。
5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中,，然后加加入抗體工作液50µl/孔,，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻,。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min,。
6、將孔內(nèi)液體甩干,，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次,，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。
7,、每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min,。將孔內(nèi)液體甩干,，用洗滌液充分洗，4～5遍（同上）,，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。
8、顯色：加入底物A液50µl/孔,，再加入底物B液50µl/孔,，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min,。
9,、測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻,，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值,。
七,、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法,，定量判定用第2種方法,。注意樣本吸光度值與其所含氨芐青霉素量成負(fù)相關(guān),。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml),。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243,； 0.1ppb為1.816,；0.3ppb為1.415；0.9ppb為0.74,；2.7ppb為0.313,；8.1ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb,；樣本2的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb,，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氨芐青霉素實(shí)際濃度。
2,、定量分析
（1）百分吸光率的計(jì)算,，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%,，即
百分吸光度值（%）＝ B ×100%
B0
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),，以氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氨芐青霉素實(shí)際濃度,。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析,。八,、 注意事項(xiàng)
1、室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低,。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作,。
3,、混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。
4,、反應(yīng)終止液為2M硫酸,，避免接觸皮膚。
5,、不要使用過了有效日期的試劑盒,；稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值變化,；不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑,。
6、不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封,；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感,，因此要避免直接暴露在光線下。
7,、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí),，表示試劑可能變質(zhì),。
8、該試劑盒zui佳反應(yīng)溫度為25℃,，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。
九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期
1,、儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存,，不要冷凍。
2,、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,，酶標(biāo)板仍然正常有效,，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請放心使用,。
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