蜂蜜檢測產(chǎn)品：

青霉素

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,，樣本中的殘留物青霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗青霉素抗體，加入酶標(biāo)記物后,，用TMB底物顯色,，樣本吸光值與其所含殘留物青霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物青霉素的含量,。

二,、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   0.1ppb
• 孵育溫度：       25℃
• 孵育時間：       30min～30min～15min
• 樣本檢測下限

組織、蜂蜜,、牛奶 ································  2ppb

蜂蜜,、牛奶樣本因存在一定的干擾，定量檢測下限為4ppb

• 交叉反應(yīng)率

青霉素·   ········································  100%

氨芐青霉素········································  0.8%

鄰氯青霉素 ·······································  0.2%

雙氯青霉素 ·······································  0.1%

阿莫西林  ·········································  0.1%

頭孢塞呋  ·········································  0.1%

• 樣本回收率

組  織 ·········································  75±19%

蜂蜜 ,、牛奶 ··································  70±17%

三,、試劑盒組成

四,、所用儀器,、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器,、振蕩器,、離心機、刻度移液管,、天平（感量0.01g）,、氮吹儀、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl,、單道100～1000µl,、多道 30～300 µl

試      劑：氫氧化鈉、乙腈,、正己烷,、亞硝基鐵氰化na、硫酸鋅

五,、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭,，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,，必要時可對實驗器具進行清潔,，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

• 樣本前處理需配制：

配液1   C液（牛奶,、奶粉樣本）：

 10.7g 亞硝基鐵氰化na加去離子水100ml溶解,。

配液2   D液（牛奶,、奶粉樣本）： 

28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解。

配液3  0.1M NaOH溶液

0.4gNaOH加去離子水100ml溶解,。

配液4  乙*腈-0.1M NaOH溶液

84ml乙腈16ml 0.1M NaOH混合均勻

配液5  樣本復(fù)溶液：

將5X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：4稀釋,。

配液6  1M NaOH溶液

        4g NaOH加去離子水100ml溶解

• 樣本處理：

（a）組織（雞、鴨,、豬肉/豬肝,、蝦、魚)樣本處理方法

• 稱取2±0.05g均質(zhì)后樣本于50ml離心管中,，加入2ml 1M NaOH溶液,，渦旋2min，再加入8ml乙腈振蕩5min,，室溫4000r/min以上離心10min,；
• 取出1ml上清液，在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥,；
• 加入1 ml樣本復(fù)溶液溶解干燥殘留物,，混合30s；將溶解后的樣本液按1：3（50µl樣本液加150µl樣本復(fù)溶液）稀釋,，混合30s,；
• 取50 µl用于分析

樣本稀釋倍數(shù):  20倍

（b）蜂蜜處理方法

• 準(zhǔn)確稱取1±0.05g蜂蜜樣本于離心管中，加入3ml 樣本復(fù)溶液,，振蕩混勻后靜置20min,；室溫4000r/min 以上離心10min；
• 取上層液體用樣本復(fù)溶液按1：4（20µl樣本液+80µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋,，混合30s,；
• 取50µl用于分析

樣本稀釋倍數(shù):  20倍 

（c） 牛奶樣本處理方法一

• 取2ml鮮牛奶于5ml離心管，加入50µlC液混勻,；
• 加入50 µl D液振蕩1min,，10℃ 4000r/min以上離心10min；
• 取上層清亮液體用樣本復(fù)溶液按1： 19（20µl樣本液+380µl樣本復(fù)溶液）稀釋,，混合30s,；
• 取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：20

注：如果離心后仍然渾濁,，再重復(fù)沉淀過程,。

（d）牛奶樣本處理方法二

• 取2ml去除脂肪奶樣至離心管中；
• 加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min,，15℃ 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液,，在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥,；
• 用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后,，再加入1ml樣本復(fù)溶液混合30s，離心去除正己烷相,；
• 取下層相用樣本復(fù)溶液按1：3 （50µl樣本液加150µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋,，混合30s；
• 取50µl用于分析,。

樣本稀釋倍數(shù):  20倍 

六,、 酶標(biāo)免疫分析程序:

• 測定前應(yīng)須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
• 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃,。
• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的*性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點,。
• 所有恒溫孵育過程,，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板,。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻,。
• 取出框架及需要數(shù)量的微孔,，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃,。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水）,，或按所需用量配制洗滌液。
• 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
• 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中,，然后加加入抗體工作液50µl/孔,，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻,。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min,。
• 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次,，每次間隔15～30秒,，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
• 每孔加入酶標(biāo)記物100µl,，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min,。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗,，4～5遍（同上）,，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。
• 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
• 測定：加入終止液50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)）,，測定每孔OD值,。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法,，粗略判定可用第1種方法,，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含青霉素量成負(fù)相關(guān),。

1,、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,，樣本2的吸光度值為1.0,，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816,；0.3ppb為1.415,；0.9ppb為0.74；2.7ppb為0.313,；8.1ppb為0.155,。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中青霉素實際濃度,。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算,，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值,，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),，以青霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中青霉素實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確,、快速分析,。

八、 注意事項

• 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低,。
• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
• 混合要均勻,，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。
• 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚,。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒,；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化,；不要交換使用不同批號的盒中試劑,。
• 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,，因此要避免直接暴露在光線下,。
• 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之,。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時,，表示試劑可能變質(zhì)。
• 該試劑盒jia反應(yīng)溫度為25℃,，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

• 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存,，不要冷凍,。
• 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒,。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果,，請放心使用,。

   公司的獸藥殘留快速檢測試劑盒（例：克倫特羅檢測試劑盒、氯霉素檢測試劑盒,、硝基呋喃類檢測試劑盒）,、動物疾病診斷試劑（例：豬弓形蟲抗體檢測試劑盒、豬藍耳病檢測試劑盒,、豬瘟病毒檢測試劑盒）,、分子生物學(xué)工具酶,、綠色水產(chǎn)藥品等一系列的產(chǎn)品已在國家機關(guān)、企業(yè),、科研單位廣為應(yīng)用,。