氯霉素快速檢測試劑盒說明書
一,、氯霉素檢測試劑盒說明書原理
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條 上預包被偶聯(lián)抗原,，樣本中的殘留物氯霉素將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氯霉素抗體,，加入 酶標記物后，用 TMB 底物顯色,，樣本吸光值與其所含殘留物氯霉素的含量成負相關,，與標準曲線比較即可得出相應殘留物氯霉素的含量。
二,、試劑盒特性
試劑盒靈敏度： 0.05ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min～30min～15min
- 樣本檢測下限
蛋類,、牛奶
（方法一）····························· 0.1 ppb 尿液,、血清,、腸衣、飼料,、奶粉··················· 0.05ppb 組織,、肝臟,、蜂蜜、牛奶
（方法二）············· 0.025ppb
- 交叉反應率
氯霉素· ······································· 100%
甲砜霉素 ······································ < 0.1%
氟甲砜霉素 ······································ < 0.1%
樣本回收率
組織,、肝臟 ································ | 85%±20% | ||
蜂蜜,、腸衣 ································ | 83%±25% | ||
牛奶、飼料 ································ | 75%±23% | ||
尿液,、血清 ································ | 70%±18% | ||
三,、試劑盒組成 |
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1 | 微量測試孔 | 每條 8 孔，一板 12 條 | |
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| 標準液×6 瓶 | 0ppb | 0.05ppb |
2 | 0.15ppb | 0.45ppb | |
（1ml/瓶） | |||
| 1.35ppb | 4.05ppb | |
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3 | 酶標記物 | 12ml | 紅色帽 |
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4 | 抗體濃縮液 | 1ml | 藍色帽 |
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5 | 底物 A 液 | 7ml | 白色帽 |
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6 | 底物 B 液 | 7ml | 黑色帽 |
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7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
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8 | 20X 濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
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9 | 2X 濃縮復溶液 | 50ml | 透明帽 |
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四,、所用儀器,、試劑
具備的儀器：酶標儀、均質(zhì)器,、振蕩器,、離心機、 刻度移液管,、天平（感量 0.01g）,、氮 吹儀、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200µl,、單道 100～1000µl,、
多道 30～300 µl
試 劑：乙酸乙酯、乙腈,、亞硝基鐵qing化鈉,、
葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114),、
硫酸鋅、醋酸鈉,、正己烷,、醋酸
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭,，吸取不同試 劑時要更換吸頭,。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈， 必要時可對實驗器具進行清潔,，以避免污染干擾實 驗結(jié)果,。
樣本前處理需配制：
配液 1 C 液（牛奶、奶粉樣本）：
10.7g 亞硝基鐵qing化鈉加去離子水 100ml 溶解,。
配液 2 D 液（牛奶,、奶粉樣本）：
28.8g 硫酸鋅加去離子水 100ml 溶解。 配液 3 pH4.8 100mM 醋酸鈉緩沖液（尿樣本）：稱 2.4g 醋酸鈉和 1.2ml 醋酸加去離子水500ml 溶解混合,。
配液 4 乙腈-水溶液：
V 乙腈：VH2O＝84：16
配液 5 樣本復溶液：將 2X 濃縮復溶液用去離子水按 1：1 稀釋,。
| (1 份濃縮復溶掖+1 份去離子水，用于抗體 | 氮氣流下干燥,；用 0.5ml 樣本復溶液溶解干燥 | |
| 的稀釋和樣本提取后的復溶),。 | 的殘留物，混合 30s,； | |
u | 樣本處理： | 3,、 取 50 µl 用于分析。 |
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（a）組織,、肝臟樣本處理方法 | 樣本稀釋倍數(shù)： 0.5 倍 | ||
1,、 稱取均質(zhì)后的樣本 3±0.05g 于 50ml 離心管中， | 檢測下限：0.025ppb | 定量下限：0.1 ppb | |
| 先加入 3ml 去離子水混勻后再加入 6ml 乙酸乙 | 注：我們推薦 0.1 ppb 為陽性樣本的 cut off 值,。 | |
| 酯,，振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上離心 10min,； | （e）腸衣處理方法 |
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2,、 取出 4ml 上層液體在 50-60℃氮氣流中吹干； | 1,、 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；注：干樣本需剪碎（長度 | ||
3,、 加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物,，再加 1ml | 不超 5mm）后再均質(zhì)，濕樣本需用去離子水漂 | ||
| 樣本復溶液混合 30s,，室溫 4000r/min 以上離心 | 洗 20min 以上去除表面的鹽份,，瀝干后再均質(zhì),； | |
| 5min；去除上層有機相,； | 2,、 稱 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中，加 | |
4,、 取 50 µl 下層相用于分析,。 | 入 10ml 乙酸乙酯，振蕩 2min,，室溫 4000r/min | ||
| 樣本稀釋倍數(shù): 0.5 倍 | 以上離心 10min,； |
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（b）血清血漿處理方法 | 3、 取 5ml 上層液體（相當于 0.5g 的樣本）在氮氣 | ||
1,、 取 1ml 血清或血漿至試管中,，加 2ml 乙酸乙酯 | 流下 50-60℃干燥； |
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| 振蕩 1min,；靜置使水相與有機相分層或室溫 | 4,、 加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 0.5ml | |
| 4000r/min 離心 5min,； | 樣本復溶液振蕩混合 30s,，室溫 4000r/min 以上 | |
2、 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中,，用氮氣流 | 離心 5min,；除上層有機相； | ||
| 50℃水浴中干燥,；殘留物用 1 ml 樣本復溶液溶 | 5,、 取下層 50 µl 用于分析。 | |
| 解,，混合 30s,； | 樣本稀釋倍數(shù)： 1 倍 |
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3、 取 50 µl 下層相用于分析,。 | （f）牛奶樣本處理方法一 |
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| 樣本稀釋倍數(shù): 1 倍 | 1,、 將牛奶樣本 10℃4000r/min 以上離心 10min 處 | |
（c） 尿液處理方法 | 理，吸除上層脂肪,；然后取 5ml 去除脂肪奶樣 | ||
1,、 移取 2ml 尿液到離心管中，加 pH4.8 100mM 醋 | 至 50ml 離心管中,，加入 150µl C 液出現(xiàn)沉淀,， | ||
| 酸鈉緩沖液 0.5ml 混合；加 40µl 葡萄糖苷酸酶 | 短暫振蕩后加入 150µl D 液混合,； | |
| (Merck,Art.No.4114)到稀釋的尿液中,，在 37℃ | 2,、 15℃4000r/min 以上離心 10min，移取上層液,； | |
| 水解至少 2 小時（或過夜）,； | 用樣本復溶液以等體積稀釋上層液，混合 30s,； | |
2,、 該溶液恢復至室溫后加入 8ml 乙酸乙酯混合 | 3、 取 50µl 用于分析,。 |
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| 1min,；室溫 4000r/min 離心 10min，取出 4ml | 注：如果離心后仍然渾濁,，再重復沉淀過程,。 | |
| 上層液體在氮氣下 50～60℃干燥； | 樣本稀釋倍數(shù)：2 |
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3,、 用 1ml 樣本復溶液溶解干燥的殘留物,，混合 | 檢測下限：0.1ppb | 定量下限：0.15ppb | |
| 30s； | （g）牛奶樣本處理方法二 |
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4,、 取 50µl 用于分析,。 | 1、 將牛奶樣本 10℃4000r/min 以上離心 10min 處 | ||
| 樣本稀釋倍數(shù): 1 倍 | 理,，吸除上層脂肪,；然后取 5ml 去除脂肪奶樣 | |
（d）蜂蜜處理方法 | 至 50ml 離心管中，加入 250µl C 液和 250µl D | ||
1,、 取 2±0.05 g 蜂蜜,，放入離心管中，用 4ml 去離 | 液*混合,，4-12℃4000r/min 以上離心 10min,。 | ||
| 子水溶解；加入 4ml 乙酸乙酯振蕩 2min,，室溫 | 如無冷凍離心機,，將樣本置冰箱中冷卻到 8℃； | |
| 4000r/min 以上離心 10min,； | 2,、 轉(zhuǎn)移出 2.2ml 上層液（相當于 2ml 奶樣）至新 | |
2、 移取 2ml 上層清澈液到另一離心管中,，50-60℃ | 的離心管中,，加入 4ml 乙酸乙酯上振蕩 2min； | ||
室溫（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min ； 3,、 吸取2ml 乙酸乙酯上層液體（相當于1ml 奶樣），
50-60℃氮氣流下*干燥,；用 0.5ml 樣本復溶 液溶解干燥的殘留物,，混合 30s；
4,、 取 50µl 用于分析,。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5
檢測下限：0.025ppb 定量檢測限：0.05ppb
由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾 （在某些 情況下干擾數(shù)值在標準 2 到 3 之間），所以推 薦標準 3 作為陽性結(jié)果的 CUT OFF 判斷值,。
（h）奶粉樣本處理方法
1,、 稱 2±0.05 g 奶粉至 50ml 離心管中，加入 10ml去離子水振蕩溶解,；加入 1ml C 液和 1ml D 液*混合,；4-12℃4000r/min 以上離心 10min。若無冷凍離心機,，請預先將樣本冷卻到 8℃,；
2、 轉(zhuǎn)移出 3.6ml 上層液（相當于 0.6g 奶粉）至新 的離心管中,，加入 6ml 乙酸乙酯振蕩 5min,；室 溫（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min；
3,、 吸取 4ml 乙酸乙酯上層液體（相當于 0.4g 奶 粉）,，50-60℃氮氣流下*干燥；用 0.4ml 樣本復溶液溶解干燥的殘留物,，混合 30s,；
4、 取 50 µl 用于分析,。
樣本稀釋倍數(shù)：1
檢測下限：0.05ppb 定量檢測限：0.15ppb
由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾 （在某些情況下干擾數(shù)值在標準 2 到 3 之間）,，所以推薦 標準 3 作為陽性結(jié)果的 CUT OFF 判斷值。
（i）蛋類處理方法
1,、 稱取 3±0.05 g 均質(zhì)的樣本,，加入 9ml 乙腈-水溶 液振蕩 2min，15℃4000r/min 以上離心 10min,；
2,、 取 3ml 上層相與 3ml 去離子水水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯,，混合 1min,，15℃4000r/min 以上離心 10min；取上層有機相置 50-60℃下氮氣 流吹干；
3,、 加入 1ml 正己烷溶解殘留物后,，用 2ml 樣本復 溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 5min,；去除上層有機相,；
4、 取 50 µl 用于分析,。
樣本稀釋倍數(shù)：
| 檢測下限：0.1ppb | 定量檢測限：0.3ppb | 7,、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔 | ||||
（j）飼料處理方法 |
| 洗板 4～5 次,，每次間隔 15～30 秒,，用吸水紙 | |||||
1、 稱取 2±0.05g 均質(zhì)過的飼料樣本,，加入 2ml 去 | 拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺 | ||||||
| 離子水,，再加入 6ml 乙酸乙酯，充分振蕩 2min,， | 破）,。 |
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| 15℃ 4000r/min 以上離心 10min； | 8,、 每孔加入酶標記物100µl,，蓋板膜蓋板后置25℃ | |||||
2、 取 3ml 上層有機相到試管中 56℃下氮氣吹干,； | 環(huán)境中反應 30min,。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌 | ||||||
3,、 加入 1ml 正己烷溶解殘留物,，用 1ml 樣本復溶 | 液充分洗，4～5 遍（同上）,，用吸水紙拍干（拍 | ||||||
| 液混合 30s,，室溫 4000r/min 以上離心 5min；去 | 干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。 | |||||
| 除上層有機相,； |
| 9、 顯色：加入底物 A 液 50µl/孔,，再加入底物 B | ||||
4,、 取 50 µl 用于分析。 |
| 液 50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境中避光顯 | |||||
| 樣本稀釋倍數(shù)：1 |
| 色 15min。 |
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六、 酶標免疫分析程序: |
| 10,、 測定：加入終止液 50µl/孔,，輕輕振蕩混勻， | |||||
| 設定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/63 | ||||||
u | 測定前應須知： |
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| 0nm 檢測,，5min 內(nèi)讀數(shù)）,，測定每孔 OD 值。 | ||||||
1,、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫 | |||||||
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| （20～25℃）。 |
| 七,、結(jié)果判定 |
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2,、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。 | 結(jié)果判定有兩種方法,，粗略判定可用第 1 種方 | ||||||
3,、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 | 法,，定量判定用第 2 種方法,。注意樣本吸光度值與 | ||||||
| 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 | 其所含氯霉素量成負相關,。 |
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| 程序中的要點,。 |
| 1、粗略判定： |
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4,、 所有恒溫孵育過程,，避免光線照射，用蓋板膜 | 用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出 | ||||||
| 蓋住微孔板,。 |
| 其濃度范圍(ng/ml),。假設樣本 1 的吸光度值為 0.3， | ||||
u | 操作步驟： |
| 樣本 2 的吸光度值為 1.0,，標準液吸光度值分別是： | ||||
1,、 從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～ | 0ppb 為 2.243,；0.05ppb 為 1.816,；0.15ppb 為 1.415； | ||||||
| 25℃）平衡 30min 以上,，注意每種液體試劑使 | 0.45ppb 為 0.74,；1.35ppb 為 0.313；4.05ppb 為 0.155,。 | |||||
| 用前均須搖勻,。 |
| 則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb～4.05ppb；樣本 2 | ||||
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔,，將不用的微孔放 | 的濃度范圍是 0.15ppb～0.45ppb,，乘以其對應的稀 | ||||||
| 入自封袋，保存于 2-8℃,。 | 釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度,。 | |||||
3、 配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去 | 2,、定量分析 |
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| 離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份 | （1）百分吸光率的計算,，標準品或樣本的百分 | |||||
| 去離子水），或按所需用量配制洗滌液,。 | 吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙 | |||||
4,、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每 | 孔）除以*個標準（0 標準）的吸光度值,，再乘 | ||||||
| 個樣本和標準品做 2 孔平行,，并記錄標準孔和 | 以 100%，即 |
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| 樣本孔所在的位置,。 |
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| B |
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5,、 將濃縮抗體用樣本復溶液 11 倍稀釋（1 份抗體 | 百分吸光率（%）＝ | ×100% | |||||
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加入 10 份稀釋液，按需配制使用） | B0 | ||||||
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 | |||||||
6,、 加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中,，然后加 | |||||||
B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值 | |||||||
加入抗體工作液 50µl/孔，用蓋板膜封板,，輕輕 | |||||||
（2）標準曲線的繪制與計算 | |||||||
振蕩混勻,。25℃環(huán)境中反應 30min。 | |||||||
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| 以標準品百分吸光率為縱坐標,，以氯霉素標準 | ||||||
品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標,，繪制標準曲線 圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,，從標準 曲線上讀出樣本所對應的濃度,，乘以其對應的稀釋 倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算,，更便于 大量樣本的準確,、快速分析。
八,、 注意事項
1,、 室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。
2,、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會 伴隨著標準曲線不成線性,，重復性不好的現(xiàn)象。 所以洗板拍干后應立即進行下一步操作,。
3,、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象,。
4,、 反應終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚,。
5,、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜 使用會引起靈敏度,、OD 值變化,；不要交換使用 不同批號的盒中試劑。
6,、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質(zhì) 和無色的發(fā)色劑對光敏感,，因此要避免直接暴 露在光線下,。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應當棄之,。標 準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能 變質(zhì),。
8,、 該試劑盒*反應溫度為 25℃，溫度過高或過 低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。
九,、儲藏條件和保質(zhì)期
1、 儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存,，不要冷凍,。
2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年,，生產(chǎn)日期見 包裝盒,。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正 常有效,，不影響實驗結(jié)果,，請放心使用。
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