EF02103 2014-01 版

孔雀石綠快速檢測(cè)試劑盒說明書

一,、原理

孔雀石綠快速檢測(cè)試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 方法,，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物孔雀石綠將和 微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗孔雀石綠抗體,， 加入酶標(biāo)記物后,，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值 與其所含殘留物孔雀石綠的含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物孔雀石綠的含量,。

二、試劑盒特性

試劑盒靈敏度：  0.05ppb

孵育溫度：    25℃

孵育時(shí)間：    30min～30min～15min

樣本檢測(cè)限

水樣 ———— 0.1ppb

水產(chǎn)品 ————0.5ppb

交叉反應(yīng)率

樣本回收率

水樣,、水產(chǎn)品 ····························  80%~110%

精密度

板內(nèi),、板間變異系數(shù)≤12%

三,、試劑盒組成

四,、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀,、均質(zhì)器、振蕩器,、離心機(jī),、 刻度移液管、天平（感量 0.01g）,、氮 吹儀,、恒溫箱

微量移液器：?jiǎn)蔚?20～200µl、單道 100～1000µl,、

多道 30～300 µl

試 劑：乙腈,、二氯甲烷、無水硫酸鈉,、正己烷

五,、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試 劑時(shí)要更換吸頭,。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,， 必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí) 驗(yàn)結(jié)果,。

樣本前處理需配制： 配液 1 樣品提取液乙腈-二氯甲烷混合溶液：

V _乙腈-V _二氯甲烷 = 4 : 1,，取 40ml 乙腈， 再加入 10ml 二氯甲烷,，混勻后使用,。

配液 2 樣品復(fù)溶液

將 4X 濃縮復(fù)溶液用去離子水按 1：3 稀釋 （1 份 4×濃縮復(fù)溶液+3 份去離子水），或按所需用 量配制,。

樣本處理：

（a）水樣處理方法

取 50µl 清澈水樣樣直接測(cè)定（如果水樣渾濁 一定要過濾或 4000r/min 離心 10min,，直至得到 清澈樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存,。

樣本稀釋倍數(shù):  1 倍

（b）水產(chǎn)品處理方法

1,、稱取 2±0.05g 均質(zhì)組織樣品于 50ml 離心管中， 加入 6ml 樣品提取液（配液 1）,，2g 無水硫酸 鈉,，振蕩 5min ，室溫（25℃左右）4000r/min以上離心 10min,；

2,、取 3ml 上清液,，加入 20µl 氧化劑，搖勻,，在 56℃ 條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥,；

3、加入 1ml 正己烷,，加入 1ml 樣品復(fù)溶液（配液

2）,，振蕩搖勻 1min，4000r/min 以上離心 5min,；

4,、取下層 50 µl 用于分析；

樣本稀釋倍數(shù):  1 倍

注：此方法所得到的結(jié)果為孔雀石綠,；隱性孔 雀石綠,；結(jié)晶紫；隱性結(jié)晶紫的總量,。

六,、酶標(biāo)免疫分析程序:

測(cè)定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫 （20～25℃）,。

2,、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。

3,、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測(cè)定 程序中的要點(diǎn),。

4,、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射,，用蓋板膜 蓋住微孔板,。

操作步驟：

1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,，室溫（20～ 25℃）平衡 30min 以上,，注意每種液體試劑使 用前均須搖勻。

2,、取出框架及需要數(shù)量的微孔,，將不用的微孔放 入自封袋，保存于 2-8℃,。

3,、配液 1：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去 離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份 去離子水），或按所需用量配制洗滌液,。

配液 2：

配制孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液：取一定量的 10 倍濃縮

標(biāo)準(zhǔn)液用樣品復(fù)溶液 10 倍稀釋,，現(xiàn)配現(xiàn)用， 具體如下：

標(biāo)準(zhǔn)液6：配制4.05ppb 標(biāo)準(zhǔn)液--取50ul 40.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加 450ul 樣品復(fù)溶液混勻,；

標(biāo)準(zhǔn)液5：配制1.35ppb 標(biāo)準(zhǔn)液--取50ul 13.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加 450ul 樣品復(fù)溶液混勻,；

標(biāo)準(zhǔn)液 4：配制 0.45ppb 標(biāo)準(zhǔn)液--取 50ul 4.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加 450ul 樣品復(fù)溶液混勻,；

標(biāo)準(zhǔn)液 3：配制 0.15ppb 標(biāo)準(zhǔn)液--取 50ul 1.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加 450ul 樣品復(fù)溶液混勻；

標(biāo)準(zhǔn)液 2：配制 0.05ppb 標(biāo)準(zhǔn)液--取 50ul 0.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加 450ul 樣品復(fù)溶液混勻,；

標(biāo)準(zhǔn)液 1：配制 0ppb 標(biāo)準(zhǔn)液--取 50ul 0ppb 標(biāo)準(zhǔn)液加 450ul 樣品復(fù)溶液混勻,；

4、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),，每 個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行,，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和 樣本孔所在的位置。

5,、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加 入抗體工作液 50µl/孔,，用蓋板膜封板,，輕輕振 蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng) 30min,。

6,、將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔 洗板 4～5 次,，每次間隔 15～30 秒,，用吸水紙 拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺 破）。

7,、每孔加入酶標(biāo)記物 100µl,，蓋板膜蓋板后置25℃ 環(huán)境中反應(yīng) 30min。將孔內(nèi)液體甩干,，用洗滌 液充分洗,，4～5 遍（同上），用吸水紙拍干（拍 干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。

8,、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境中避光顯 色 15min。

9,、測(cè)定：加入終止液 50µl/孔,，輕輕振蕩混勻，設(shè) 定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長(zhǎng) 450/630n m 檢測(cè)，5min 內(nèi)讀數(shù)）,，測(cè)定每孔 OD 值,。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法,，粗略判定可用第 1 種方 法,，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與 其所含孔雀石綠量成負(fù)相關(guān),。

1,、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出 其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3,， 樣本 2 的吸光度值為 1.0,，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：

0ppb 為 2.243；0.05ppb 為 1.816,；0.15ppb 為 1.415,； 變質(zhì)。

0.45ppb 為 0.74,；1.35ppb 為 0.313,；4.05ppb 為 0.155。  8,、該試劑盒zui佳反應(yīng)溫度為 25℃,，溫度過高或過

則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb～4.05ppb；樣本 2的濃度范圍是 0.15ppb～0.45ppb,，乘以其對(duì)應(yīng)的稀 釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實(shí)際濃度,。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算,，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分 吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙 孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值,，再乘 以 100%，即

B

百分吸光率（%）＝ ×100% B₀

低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。

九,、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期

1、儲(chǔ)藏條件：試劑盒于 2-8℃保存,，不要冷凍,。 2、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年,，生產(chǎn)日期見

包裝盒,。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正 常有效,，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，請(qǐng)放心使用。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B₀—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線圖,。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo) 準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,，乘以其對(duì)應(yīng)的稀 釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實(shí)際濃度,。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于 大量樣本的準(zhǔn)確,、快速分析,。

八、 注意事項(xiàng)

1,、室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低,。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會(huì) 伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。 所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作,。

3,、混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。

4、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸,，避免接觸皮膚,。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒,；稀釋或攙雜 使用會(huì)引起靈敏度,、OD 值變化；不要交換使用 不同批號(hào)的盒中試劑,。

6,、不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感,，因此要避免直接暴 露在光線下,。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之,。標(biāo) 準(zhǔn)品 1 的吸光度值小于 0.5 時(shí)，表示試劑可能

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