志賀氏菌屬產(chǎn)品介紹
本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術,，用于志賀氏菌的PCR體外特異性檢測。檢測靈敏度為100拷貝/mL,。定量檢測線性范圍為：10-1010拷貝/mL,。
志賀氏菌屬試劑盒組成
| 規(guī)格 | 48次檢測 |
| DNA提取液 | 3mL/管 |
| 志賀氏菌PCR反應液 | 1100µL/管 |
| Taq酶（5U/µL） | 24µL /管 |
| 志賀氏菌陽性對照 | 100µL/管 |
| 志賀氏菌陰性對照 | 100µL/管 |
| 說明書 | 1份 |
實驗操作步驟：
1. DNA提取：取增菌液1mL加到1.5mL無菌離心管中,，10,000rpm離心5min,，棄去上清；加入50µL DNA提取液,，充分混勻后沸水浴5 min,，13,000rpm離心5min，取上清液進行檢測或保存于-20℃以待檢測,。
2. 擴增試劑準備（在試劑貯存和準備區(qū)完成）
2.1. 從試劑盒中取出PCR反應液,，冰盒上融化后混勻。試劑在使用前2000rpm離心20s備用,。
2.2. 設需要的PCR反應管管數(shù)為N（N = 待檢樣本數(shù)+ 1管陰性對照 +1管陽性對照）,。
2.3. 混合液的配制：先吸取體積為22.6（µL）×N反應液1.5mL滅菌離心管，再加入Taq DNA聚合酶0.4 （µL）×N,，混勻后2000rpm離心20s,，然后向N 個0.2mL PCR反應管中分裝已加入Taq酶的混合液23µL/每管，蓋緊管蓋,。
2.4. 注意：陰性對照管建議在此區(qū)中加入2µL陰性對照樣品。
3. 加樣（在樣品制備區(qū)完成）
3.1. 陽性對照取出解凍,，使用前2000rpm 離心20s,。
3.2. 將保存在-20℃的核酸提取物置室溫解凍，以13,000rpm離心5min,；向N個PCR管中分別加入待檢樣本DNA（包括陽性對照）2µL,，蓋緊管蓋，2000rpm離心20s,，將PCR反應管轉移核酸擴增區(qū),。注意做好樣品號標記。
4. PCR擴增（在核酸擴增區(qū)完成）
4.1. 上機前應檢查各反應管是否蓋緊,。
4.2. 反應體系設為25µL,；熒光信號采集設定在退火溫度。對于多通道熒光PCR儀，選擇熒光素FAM為信號采集通道,。
4.3. PCR循環(huán)參數(shù)為：*階段,，95℃ 3 min預變性；
第二階段,，[95℃ 10s,；60℃ 40s] × 40次循環(huán)。
注意：在的LightCycler上使用,，變性溫度95℃改為93℃,，其他不變。
5. 質量控制標準及結果判斷
5.1 綜合分析儀器給出的各項數(shù)據(jù)及擴增曲線,，設定合理的閾值（Threshold）和基線（Baseline）,，使儀器給出正確的結果。
5.2 陰性對照CT值應顯示為0或≥40.0,，陽性對照的CT值應≤30.0,，否則視實驗失敗，需重做,。
5.3 檢測樣品CT≤35.0,，結果有效，可直接報告樣品陽性,。
5.4 檢測樣品35.0<CT>40.0,，需進行一次重復實驗，若CT仍介于35.0和40.0之間,，且曲線有明顯的指數(shù)增長特性,，同時陰性對照Ct值為零，可報告樣品陽性,，否則報告樣品陰性,。
5.5 檢測樣品CT值為零，報告樣本陰性,。
注意事項
1. 本試劑盒僅用于體外檢測使用,，操作人員必須經(jīng)過培訓并具有一定的經(jīng)驗，試劑盒使用前請仔細閱讀說明書全文,。 2. 請嚴格按照基因擴增檢驗實驗室的管理規(guī)范進行實驗操作,。
3. PCR實驗嚴格分區(qū)操作；各區(qū)應有的手套,、移液器等,，不得交叉使用，避免污染,；工作人員應遵循從一區(qū)到二區(qū)的單方向工作原則,，各工作區(qū)相對隔離,；進行PCR實驗的工作桌面和及相關物品應定期用1%次氯酸鈉、75%酒精,、1mol/L鹽酸或紫外燈進行滅菌和消毒,。
4. 試劑盒中各試劑充分融化后請短暫離心。反應液分裝時應盡量避免產(chǎn)生氣泡,。上機前應注意檢查各反應管是否蓋緊,，以免污染儀器。
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