本試劑盒采用TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù),，用于志賀氏菌的PCR體外特異性檢測(cè)。檢測(cè)靈敏度為100拷貝/mL,。定量檢測(cè)線性范圍為：10-1010拷貝/mL,。
| 規(guī)格 | 48次檢測(cè) |
| DNA提取液 | 3mL/管 |
| 志賀氏菌PCR反應(yīng)液 | 1100µL/管 |
| Taq酶（5U/µL） | 24µL /管 |
| 志賀氏菌陽(yáng)性對(duì)照 | 100µL/管 |
| 志賀氏菌陰性對(duì)照 | 100µL/管 |
| 說(shuō)明書 | 1份 |
貯存與運(yùn)輸條件
本試劑盒必須在-20℃下避光保存，有效期為6個(gè)月,。
實(shí)驗(yàn)操作步驟
1. DNA提?。?/b>取增菌液1mL加到1.5mL無(wú)菌離心管中，10,000rpm離心5min,，棄去上清,；加入50µL DNA提取液，充分混勻后沸水浴5 min,，13,000rpm離心5min,，取上清液進(jìn)行檢測(cè)或保存于-20℃以待檢測(cè)。
2. 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)完成）
2.1. 從試劑盒中取出PCR反應(yīng)液,，冰盒上融化后混勻,。試劑在使用前2000rpm離心20s備用。
2.2. 設(shè)需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N = 待檢樣本數(shù)+ 1管陰性對(duì)照 +1管陽(yáng)性對(duì)照）,。
2.3. 混合液的配制：先吸取體積為22.6（µL）×N反應(yīng)液1.5mL滅菌離心管,，再加入Taq DNA聚合酶0.4 （µL）×N，混勻后2000rpm離心20s,，然后向N 個(gè)0.2mL PCR反應(yīng)管中分裝已加入Taq酶的混合液23µL/每管，蓋緊管蓋,。
2.4. 注意：陰性對(duì)照管建議在此區(qū)中加入2µL陰性對(duì)照樣品,。
3. 加樣（在樣品制備區(qū)完成）
3.1. 陽(yáng)性對(duì)照取出解凍，使用前2000rpm 離心20s,。
3.2. 將保存在-20℃的核酸提取物置室溫解凍,，以13,000rpm離心5min；向N個(gè)PCR管中分別加入待檢樣本DNA（包括陽(yáng)性對(duì)照）2µL,，蓋緊管蓋,，2000rpm離心20s，將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移核酸擴(kuò)增區(qū),。注意做好樣品號(hào)標(biāo)記,。
4. PCR擴(kuò)增（在核酸擴(kuò)增區(qū)完成）
4.1. 上機(jī)前應(yīng)檢查各反應(yīng)管是否蓋緊。
4.2. 反應(yīng)體系設(shè)為25µL；熒光信號(hào)采集設(shè)定在退火溫度,。對(duì)于多通道熒光PCR儀,，選擇熒光素FAM為信號(hào)采集通道。
4.3. PCR循環(huán)參數(shù)為：*階段,，95℃ 3 min預(yù)變性,；
第二階段，[95℃ 10s,；60℃ 40s] × 40次循環(huán),。
注意：在的LightCycler上使用，變性溫度95℃改為93℃,，其他不變,。
5.1 綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù)及擴(kuò)增曲線，設(shè)定合理的閾值（Threshold）和基線（Baseline）,，使儀器給出正確的結(jié)果,。
5.2 陰性對(duì)照CT值應(yīng)顯示為0或≥40.0，陽(yáng)性對(duì)照的CT值應(yīng)≤30.0,，否則視實(shí)驗(yàn)失敗,，需重做。
5.3 檢測(cè)樣品CT≤35.0,，結(jié)果有效,，可直接報(bào)告樣品陽(yáng)性。
5.4 檢測(cè)樣品35.0<CT>40.0,，需進(jìn)行一次重復(fù)實(shí)驗(yàn),，若CT仍介于35.0和40.0之間，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)特性,，同時(shí)陰性對(duì)照Ct值為零,，可報(bào)告樣品陽(yáng)性，否則報(bào)告樣品陰性,。
5.5 檢測(cè)樣品CT值為零,，報(bào)告樣本陰性。
適用熒光PCR儀品牌與型號(hào)
l Cepheid公司的SmartCycler
l ABI公司的Prism7000,、7700,、7500、9600系列
l Stratagene公司的MX3000,、MX4000
l Corbett Research公司的Rotor-Gene 3000
l Bio-Rad公司的iCycler系列,、MJ opticon2
l 公司的LightCycler等
注意事項(xiàng)
1. 本試劑盒僅用于體外檢測(cè)使用，操作人員必須經(jīng)過(guò)培訓(xùn)并具有一定的經(jīng)驗(yàn),，試劑盒使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書全文,。
2. 請(qǐng)嚴(yán)格按照基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,。
3. PCR實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格分區(qū)操作；各區(qū)應(yīng)有的手套,、移液器等,，不得交叉使用，避免污染,；工作人員應(yīng)遵循從一區(qū)到二區(qū)的單方向工作原則,，各工作區(qū)相對(duì)隔離；進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)的工作桌面和及相關(guān)物品應(yīng)定期用1%次氯酸鈉,、75%酒精,、1mol/L鹽酸或紫外燈進(jìn)行滅菌和消毒。
4. 試劑盒中各試劑充分融化后請(qǐng)短暫離心,。反應(yīng)液分裝時(shí)應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡,。上機(jī)前應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免污染儀器,。
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北京索萊寶科技有限公司 |
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