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空腸彎曲菌（c．jejuni）熒光定量PCR檢測試劑盒說明書

閱讀：2232      發(fā)布時間：2010-11-12
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產(chǎn)品介紹
本試劑盒采用分子信標實時熒光PCR技術,，用于空腸彎曲菌的PCR體外特異性檢測。檢測靈敏度為100拷貝/mL,。定量檢測線性范圍為：10-10¹⁰拷貝/mL,。
試劑盒組成

規(guī)格

48次檢測

DNA提取液

3mL/管

空腸彎曲菌PCR反應液

1100µL/管

Taq酶（5U/µL）

24µL /管

空腸彎曲菌陽性對照

100µL/管

空腸彎曲菌陰性對照

100µL/管

說明書

1份

貯存與運輸條件
本試劑盒必須在-20℃下避光保存，有效期為6個月,。
實驗操作步驟
1.         DNA提?。?/b>取增菌液1mL加到1.5mL無菌離心管中，10,000rpm離心5min,，棄去上清,；加入50µL DNA提取液，充分混勻后沸水浴5 min,，13,000rpm離心5min,，取上清液進行檢測或保存于-20℃以待檢測。
2.         擴增試劑準備（在試劑貯存和準備區(qū)完成）
2.1.        從試劑盒中取出PCR反應液,，冰盒上融化后混勻,。試劑在使用前2000rpm離心20s備用。
2.2.        設需要的PCR反應管管數(shù)為N（N = 待檢樣本數(shù)+ 1管陰性對照 +1管陽性對照）,。
2.3.        混合液的配制：先吸取體積為22.6（µL）×N反應液1.5mL滅菌離心管,，再加入Taq DNA聚合酶0.4 （µL）×N,，混勻后2000rpm離心20s，然后向N 個0.2mL PCR反應管中分裝已加入Taq酶的混合液23µL/每管,，蓋緊管蓋,。
2.4.        注意：陰性對照管建議在此區(qū)中加入2µL陰性對照樣品。
3.         加樣（在樣品制備區(qū)完成）
3.1.        陽性對照取出解凍,，使用前2000rpm 離心20s,。
3.2.        將保存在-20℃的核酸提取物置室溫解凍，以13,000rpm離心5min,；向N個PCR管中分別加入待檢樣本DNA（包括陽性對照）2µL，蓋緊管蓋,，2000rpm離心20s,，將PCR反應管轉移核酸擴增區(qū)。注意做好樣品號標記,。
4.         PCR擴增（在核酸擴增區(qū)完成）
4.1.        上機前應檢查各反應管是否蓋緊,。
反應體系設為25µL；熒光信號采集設定在退火溫度,。對于多通道熒光PCR儀,，選擇熒光素FAM為信號采集通道。
PCR循環(huán)參數(shù)為：*階段,，95℃ 3 min預變性,；
第二階段，[95℃ 15s,；55℃ 40s,；72℃ 15s] × 40次循環(huán)
注意：在的LightCycler上使用，變性溫度95℃改為93℃,，其他不變,。
5.         質(zhì)量控制標準及結果判斷
5.1   綜合分析儀器給出的各項數(shù)據(jù)及擴增曲線，設定合理的閾值（Threshold）和基線（Baseline）,，使儀器給出正確的結果,。
5.2   陰性對照C_T值應顯示為0或≥40.0，陽性對照的C_T值應≤30.0,，否則視實驗失敗,，需重做。
5.3   檢測樣品C_T≤35.0,，結果有效,，可直接報告樣品陽性。

5.4   檢測樣品35.0<C_T>40.0,，需進行一次重復實驗,，若C_T仍介于35.0和40.0之間,，且曲線有明顯的指數(shù)增長特性，同時陰性對照Ct值為零,，可報告樣品陽性,，否則報告樣品陰性。
5.5   檢測樣品C_T值為零,，報告樣本陰性,。
適用熒光PCR儀品牌與型號
l         Cepheid公司的SmartCycler
l         ABI公司的Prism7000、7700,、7500,、9600系列
l         Stratagene公司的MX3000、MX4000
l         Corbett Research公司的Rotor-Gene 3000
l         Bio-Rad公司的iCycler系列,、MJ opticon2
l         公司的LightCycler等

注意事項
1.         本試劑盒僅用于體外檢測使用,，操作人員必須經(jīng)過培訓并具有一定的經(jīng)驗，試劑盒使用前請仔細閱讀說明書全文,。
2.         請嚴格按照基因擴增檢驗實驗室的管理規(guī)范進行實驗操作,。
3.         PCR實驗嚴格分區(qū)操作；各區(qū)應有的手套,、移液器等,，不得交叉使用，避免污染,；工作人員應遵循從一區(qū)到二區(qū)的單方向工作原則,，各工作區(qū)相對隔離；進行PCR實驗的工作桌面和及相關物品應定期用1%次氯酸鈉,、75%酒精,、1mol/L鹽酸或紫外燈進行滅菌和消毒。
試劑盒中各試劑充分融化后請短暫離心,。反應液分裝時應盡量避免產(chǎn)生氣泡,。上機前應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免污染儀器,。

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北京索萊寶科技有限公司
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規(guī)格	48次檢測
DNA提取液	3mL/管
空腸彎曲菌PCR反應液	1100µL/管
Taq酶（5U/µL）	24µL /管
空腸彎曲菌陽性對照	100µL/管
空腸彎曲菌陰性對照	100µL/管
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