選擇大約一半足孕時(shí)間的胚胎好,，10-13天齡胚胎含有大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞,，成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得,。
1. 胚胎的分離
1） 適用哺乳動(dòng)物（倉鼠、小鼠和大鼠）
a.采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動(dòng)物
b. 立即在無菌超凈臺(tái)內(nèi)用70%乙醇擦洗整個(gè)動(dòng)物,。若可能,，置紫外燈下照射5min。
c. 用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口,，用無菌鑷子將皮膚扯向后退,。
d. 用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，去除含有胚胎的子宮,，置于無菌的培養(yǎng)皿上
e. 剔除胚胎周圍的包膜,，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的燒瓶中。
f. 漂洗胚胎,，去掉PBS,。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直清洗液清亮為止。
2） 適用雞胚胎
a. 用70%乙醇擦洗雞蛋殼,。
b. 用無菌剪刀輕敲雞蛋的圓端,，輕輕去除蛋殼露出氣囊。
c. 用無菌鑷子去除覆蓋于絨毛尿囊上的白膜,。
d. 剪開包膜,，用彎鑷夾住胚胎頸部去除胚胎
e. 棄頭部，將無頭的胚胎置于廣口燒杯中,，用PBS漂洗,。
2. 將6-8個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移一個(gè)小的無菌廣口燒杯中，用新的無菌剪刀小心地絞碎胚胎,，用PBS漂洗,。
3. 在無菌狀態(tài)下，將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一500ml的無菌的有攪拌棒的燒杯中,，加200-300ml用HBSS配制的0.25%的無菌胰蛋白酶,。
4. 在溫暖的環(huán)境中或置于37℃培養(yǎng)箱中輕輕攪動(dòng)15min。
5. 讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降,，將含有懸浮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移一無菌大容積的離心管中,，該管內(nèi)按照每10ml上清加入1ml牛血清的比例加入牛血清以滅火胰蛋白酶
6. 加入新鮮胰蛋白酶溶液（見前述步驟）于含有殘留未消化組織塊的500ml燒杯中，重復(fù)步驟4和5,。
7. 離心混合的細(xì)胞懸液,，1200r/min，5min,，棄上清,。
8. 用新鮮的無菌PBS重懸沉淀的細(xì)胞，按步驟7再次離心。
9. 用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞直上清清亮為止,。
10. 用含有10%牛血清和抗生素（如青霉素,、鏈霉素）的DMEM 10ml再懸沉淀，并使終體積為100ml,。
11. 讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降,。可采用數(shù)層無菌紗布過濾細(xì)胞懸液以去除任何殘留的細(xì)胞快,。
12. 為確定現(xiàn)有細(xì)胞濃度,，加入0.2ml細(xì)胞懸液于1.8ml 1%醋酸溶液中以裂解紅細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),。
13. 按每10mm平皿1*1074*107細(xì)胞的數(shù)量接種于10ml組織培養(yǎng)液中,，在飽和濕度的37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育直細(xì)胞鋪滿。
14當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿后,，去除培養(yǎng)液,，用10%的溫暖的Versene（用PBS配制的0.53nmol/L EDTA），洗滌細(xì)胞層2次,。
15. 棄Versene,，加入相同體積的溫暖0.05%胰蛋白酶-EDTA。
16. 37℃孵育5min,。
17. 用無菌吸管輕輕吹散細(xì)胞,，并轉(zhuǎn)移一含有1-2ml牛血清的無菌管中。牛血清的終濃度約為10%,，起到中和胰蛋白酶的作用,。
18. 離心，1200r/min,，5min,，棄上清。
19. 再懸沉淀于5ml培養(yǎng)液中,，另加入15ml培養(yǎng)液,，分裝于2個(gè)100mm平皿中,。
20. 置37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞,，直細(xì)胞長(zhǎng)滿，繼續(xù)步驟14-20以傳代細(xì)胞,。
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