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細菌總蛋白和膜蛋白提取方法

閱讀：740      發(fā)布時間：2013-09-04
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驗試劑
裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl,，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100,，調(diào)pH值8.5-9.0備用,；
溶菌酶；蛋白酶抑制劑PMSF,；1% SDS溶液,；Trizol裂解液；無水乙醇,；異丙醇,；0.3M鹽酸胍；
疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114,，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,，1mM EDTA，調(diào)pH值8.0備用,。
實驗設(shè)備
高速離心機,；超聲儀；透析袋,；EP管,；渦旋儀；水浴鍋等,。
實驗步驟
1. 從新鮮樣品中提取總蛋白（簡易法）
   1）自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl,，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100,，調(diào)pH值8.5-9.0備用,；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制劑PMSF,。該裂解液用量為10-50ml 裂解液/1g濕菌體,。
   2）將40ml 菌液在12000g,，4℃下離心15分鐘收集菌體，沉淀用PBS懸浮洗滌2遍,，沉淀加入1ml裂解液懸浮菌體,。
3）超聲粉碎，采用300w,，10s超聲/10s間隔,，超聲20min，反復(fù)凍融超聲3次菌液變清或者變色,。
   4） 1000g離心去掉大碎片,，上清可直接變性后PAGE電泳檢測，或者用1% SDS溶液透析后凍存,。
缺點：Western blotting結(jié)果表明,，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。
2. 從Trizol裂解液中分離總蛋白
   1） Trizol溶解的樣品研磨破碎后,，加氯仿分層,，2-8℃下10000g離心15min，上層水相用于RNA提取,，體積約為總體積的60%,。
   2）用乙醇沉淀中間層和有機相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml無水乙醇混勻,，室溫放置3min,，2-8℃不超過2000g離心5min。
   3）將上清移新的EP管中,，用異丙醇沉淀蛋白質(zhì),。每使用1ml Trizol加入1.5ml異丙醇，室溫放置10min,，2-8℃下12000g離心10min,，棄上清。
   4）用含有0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌,。每1ml Trizol加入2ml洗液,，室溫放置20min， 2-8℃下7500g離心5min,，棄上清，重復(fù)洗滌2次,。后加入2ml無水乙醇,，渦旋后室溫放置20min，2-8℃下7500g離心5min,，棄上清,。
   5）冷凍干燥5-10min,，1%SDS溶液溶解，反復(fù)吹打,，50℃溫浴使其*溶解,，2-8℃下10000g離心10min去除不溶物。
   6）替代方案：將3中的酚醇上清液移小分子量透析袋中,，在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次,，1000g離心10min去除沉淀，上清可直接用于蛋白實驗,。
3. 從新鮮樣品中提取疏水性膜蛋白（Triton X-114去污劑法）
   1）配制疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114,，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA,，調(diào)pH值8.0備用,。
   2）菌液于4℃條件下15000g離心15min收集菌體；用1ml 含有5mM MgCl₂ 的PBS洗滌3次,，后于4℃條件下15000g離心15min收集菌體,。
   3）菌體沉淀加入1ml冷提取液，于4℃條件下放置2h,，17000g離心10min,，去除沉淀取上清。
   4）將上述上清中的Triton X-114含量增加到2%,，再加入20mM的CaCl₂抑制部分蛋白酶活性,，37℃條件下放置10min使其分層。室溫下1000g離心10min使液相和去污相充分分層,。
   5）將液相和去污相分開,，分別用10倍體積的冷丙酮在冰上沉淀45min。
   6）于4℃條件下17000g離心30min,，用去離子水洗滌沉淀3次,。
   7）將沉淀溶解在1% SDS溶液中，測定蛋白濃度,，比較液相和去污相中蛋白提取效率,，一般是去污相中疏水性膜蛋白較多，適于進一步蛋白實驗,。
   8） SDS-PAGE進一步分析液相和去污相的蛋白圖譜,。

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