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1    概述

1.1 藥物代謝研究簡介

藥物代謝研究是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要內(nèi)容,，它不僅決定了創(chuàng)新藥物制劑研發(fā)的成敗,，而且與創(chuàng)新藥物研發(fā)的速度和質(zhì)量有密切關系。因而,，藥物代謝研究在新藥研發(fā)工程中具有*的重要作用,，研究藥物代謝對于了解藥物在體內(nèi)的變化過程至關重要。

藥物代謝研究的方法主要分為體內(nèi)和體外兩種,。體內(nèi)代謝法因藥物在生物體內(nèi)的分布較廣,，加上代謝轉(zhuǎn)化的器官和酶系的多樣性，使藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的濃度比較低,，代謝產(chǎn)物的檢測具有一定的困難,。體外代謝法在短時間內(nèi)可以得到大量的代謝產(chǎn)物，且代謝條件可控,，代謝體系比較“干凈”,，代謝物易于分離、提取,，有利于代謝途徑研究及代謝產(chǎn)物結果的確定等,，因而，體外代謝法具有突出的*性,。

由于肝臟是藥物代謝的主要場所,，體外代謝模型多以肝臟為基礎。目前,，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體體外溫孵法,、重組P450酶體外溫孵法、肝細胞體外溫孵法,、肝臟離體灌流法和肝切片法,。其中，肝微粒體體外溫孵法與其他體外代謝方法相比,，酶制備簡單,，代謝過程快,，重現(xiàn)性好，易大量操作,，同時可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究,，因而在實際工作中應用較為普遍。

1.2 藥物代謝

藥物代謝,，又稱藥物的生物轉(zhuǎn)化（biotransformation），是指藥物經(jīng)過體內(nèi)吸收,、分布之后,，在藥酶的作用下經(jīng)歷化學結構變化的過程，是藥物從體內(nèi)消除的主要方式之一,。藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化,，分為Ⅰ相代謝反應和Ⅱ相代謝反應。

肝臟是藥物代謝的重要器官,，是機體進行生物轉(zhuǎn)化的主要場所,，含有參與藥物代謝Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝的各種酶。在肝臟中,，參與藥物代謝的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶中以P450酶最為重要,，它是一種以鐵卟啉為輔基的蛋白質(zhì)。P450酶存在明顯的種屬,、性別和年齡的差異,，其中以種屬差異表現(xiàn)最為明顯，不同種屬的P450同工酶的組成不同,，因此藥物在不同種屬的動物和人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物可能是不同的,。

1.3 藥物的Ⅰ相代謝

藥物在Ⅰ相代謝反應中主要發(fā)生氧化、還原和水解的反應,，經(jīng)過Ⅰ相代謝反應,，藥物可能帶有一些極性基團，如羥基,、羧基等,。

氧化反應是最多見的第Ⅰ相反應，單加氧酶系是氧化異源物最重要的酶,，單加氧酶主要存在于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體中,，能催化烷烴、烯烴,、芳烴和類固醇等多種物質(zhì)進行氧化,。由細胞色素P450、NADPH+H+,、NADPH-細胞色素P450還原酶（以FAD為輔基的黃酶）,，催化基本反應為：

RH+O2+NADPH+H+→ROH+NADP++H2O

單加氧酶能直接激活氧分子,，使其中一個氧原子直接加入底物分子中形成羥化物或環(huán)氧化物，另一個氧原子則被NADPH還原為水,。由于一個氧分子發(fā)揮了兩種功能,，故單加氧酶系又稱為混合功能氧化酶；又因底物的氧化產(chǎn)物是羥化物,，所以又稱為羥化酶,。加單氧酶的（見圖1）

圖1 加單氧酶的反應

肝細胞微粒體內(nèi)存在的還原酶主要有硝基還原酶和偶氮還原酶，是第Ⅰ相反應的主要還原酶,，能使硝基化合物和偶氮化合物還原生成胺類（見圖2）,。

圖2 硝基苯和偶氮苯的還原反應

肝微粒體中含有多種水解酶，如酯酶,、酰胺酶,、糖苷酶等，可分別催化酯類,、酰胺類,、糖苷類化合物的水解（見圖3），以降低或消除其生物活性,。

圖3 乙酰水楊酸的水解反應

2    Ⅰ相代謝穩(wěn)定性實驗原理

肝藥酶CYP即細胞色素P450氧化酶（CYP450）,，屬于單加氧酶（momooxygenase），也稱肝微粒體混合功能氧化酶,，多位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)壁上,，參與藥物、致癌物,、類固醇激素和脂肪酸等多種內(nèi),、外源性物質(zhì)代謝。肝藥酶CYP氧化還原酶（POR）是所有肝微粒體酶的電子供體,，通過還原型咽酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,，NADPH）將電子傳遞給CYP450酶，CYP450酶得到電子后再與底物發(fā)生氧化還原反應,，從而發(fā)揮代謝活性,。

肝微粒體中包含了大部分Ⅰ相酶，其中最重要的是以CYP450為主要成分的微粒體混合功能氧化酶系統(tǒng),，在用肝微粒體進行研究時,，如加入相應的輔助因子NADPH，則可重組體外代謝體系,，從而通過體外溫孵法進行Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究,。

3    肝微粒體體外溫孵法實驗方法描述

肝微粒體體外溫孵法是采用肝微粒體，輔以NADPH再生系統(tǒng),，在體外模擬生理環(huán)境條件進行代謝反應,，經(jīng)過一定時間的反應后,，采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物和其代謝產(chǎn)物,，并對代謝產(chǎn)物進行初步的分析和鑒定的方法,。

3.1 肝微粒體制備

微粒體是指在細胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結構，是異質(zhì)性的集合體,。它包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分,，在體外實驗中具有蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)糖基化和脂類合成等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本功能,。目前,，制備肝微粒體常用的方法是差速離心法。具體制備流程見下圖（見圖4）

圖4 肝微粒體制備流程圖

3.2 體外孵育體系的建立

Ⅰ相代謝穩(wěn)定性研究的肝微粒體體外孵育體系,，是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，在模擬生理溫度及生理環(huán)境的條件下進行生化反應的體系,。

以每個孵育體系總體積為200 µL為例,，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液，NADPH發(fā)生系統(tǒng)（1mM NADP,，5 mM的6-磷酸葡萄糖,，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，3.3 mM的氯化鎂）,；0.1mg/mL~1mg/mL的肝微粒體蛋白,；合適濃度的待測物，一般推薦為1μM,，于37°C水浴孵育,，每個樣品平行3次，以不包含NADPH發(fā)生系統(tǒng)的樣品作為陰性對照,。于預設的反應時間點,，如0，5,，10,，15，30,，60 min后加入等體積預冷的乙腈終止反應,。

3.3 原型藥物或代謝產(chǎn)物的檢測

采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物和其代謝產(chǎn)物,。圖5為采用LC-MS/MS測定藥物在人,、犬和大鼠肝微粒體中的代謝情況，從圖上可知,，藥物在三種肝微粒體中均存在明顯代謝,，但不同種屬間又存在顯著差異,。（見圖5）

圖5藥物在人，犬,，大鼠肝微粒體中的代謝情況

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