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生物治療藥物容易誘導(dǎo)抗藥物抗體(ADA)的產(chǎn)生,。有證據(jù)表明,，蛋白質(zhì)聚集物和顆粒具有增強(qiáng)免疫原性的能力，從而引發(fā)對(duì)蛋白質(zhì)單體形式的免疫反應(yīng),。

生物治療蛋白的制造商通常通過(guò)一系列步驟來(lái)制備用于注射的藥物,，如:

1.蛋白質(zhì)合成與純化

2.在運(yùn)輸過(guò)程中用于穩(wěn)定的凍干

3.注射前再造

雖然凍干的好處是它可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的運(yùn)輸，但目前還不清楚凍干蛋白在重組后是否會(huì)回到單體狀態(tài),。如果由于這一過(guò)程而導(dǎo)致少量的蛋白質(zhì)聚集,，就有可能在患者的治療過(guò)程中產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)測(cè)量聚集程度,，使數(shù)據(jù)在重組后以大小與濃度的直方圖顯示,，將有助于在處方過(guò)程中篩選這些藥物。這種分析可以確保重組過(guò)程在沒(méi)有大量聚集的情況 下釋放單體,。

粒子計(jì)數(shù)技術(shù)

有一些技術(shù)能夠測(cè)量顆粒大小和濃度的大小范圍的興趣,，以量化蛋白質(zhì)聚集。光阻法是許多藥學(xué)工作者所熟悉的方法,，因?yàn)樗怯糜赨SP<788>顆粒物質(zhì)注射劑和USP< 729> 測(cè)試,，以測(cè)量脂類(lèi)乳劑的尾部。但是經(jīng)典的光阻傳感器通常具有更低的粒徑限制,，接近1μm,而且對(duì)于許多蛋白質(zhì)聚集樣品,，濃度限制太低。

新的PSS AccuSizer FX-Nano系統(tǒng)(如下圖所示)被設(shè)計(jì)用于更小的顆粒尺寸和更高的濃度,。這是通過(guò)使用兩個(gè)傳感器實(shí)現(xiàn)的: FX-Nano傳感器可測(cè)量0.15-0.6μm和LE400傳感器測(cè)量0.5-40μm,。新型FX-Nano傳感器使用聚焦光束來(lái)減少檢測(cè)的總體積,從而增加了傳感器的濃度限制。該傳感器與SIS進(jìn)樣器耦合,修改后允許樣品體積低至250μm,。這種結(jié)構(gòu)的結(jié)膜通過(guò)USP <787>治療性蛋白注射中亞可見(jiàn)顆粒物質(zhì)的所有要求,。

聚合蛋白的大小和計(jì)數(shù)使用兩個(gè)傳感器,，以覆蓋0.15- 40um的動(dòng)態(tài)范圍。當(dāng)LE傳感器 單獨(dú)使用時(shí),，可以從0.5 -400 μ m,這使得這個(gè)體系非常靈活,。

數(shù)據(jù)1:  IgG過(guò)濾前后

在PBS中制備免疫球蛋白G (IgG)， ~ 150kda, 1%,。樣品未經(jīng)稀釋使用賓西澤FX- nano與FX和LE傳感器和SIS進(jìn)樣器,。結(jié)果如圖1所示?？傆?jì)#粒子計(jì)數(shù)= 109,343, 濃度= 9.7 x 10 粒子/毫升,。

 圖1:未過(guò)濾的IgG

樣品還在Particle Sizing Systems Nicomp 380動(dòng)態(tài)光散射(DLS)系統(tǒng)上進(jìn)行了分析，如圖2所示,以評(píng)估單體的大小,，并大致了解聚合蛋白的大小,。峰1(天然蛋白):14.6nm(99.6%總質(zhì)量)。# 2(聚合達(dá)到max)：395nm（總質(zhì)量0.4%）,。這是在200-500納米和更大的聚集體的尾部,。

 圖2：未過(guò)濾的1gG的DLS Nicomp 360數(shù)據(jù)

然后蛋白樣品通過(guò)0.2μm過(guò)濾器，在Accuizer FX-Nano系統(tǒng)上再次分析,，過(guò)濾前后對(duì)比結(jié)果如圖3所示,。PBS的結(jié)果也顯示為黑色。

圖3:過(guò)濾前(藍(lán)色)和過(guò)濾后(紅色)

數(shù)據(jù)2: 培育前后的IgG

用樣品制備方法研究培育對(duì)IgG蛋白樣品的影響,。圖4顯示 了IgG樣品在37°C培育前,、培育1小時(shí)和6小時(shí)后的粒徑分布。樣品單獨(dú)使用Accuizer FX系統(tǒng)測(cè)量,。將聚合蛋白定義為>0.7μm, 其濃度分別為9.77,、7.75、5.08 x 105顆/毫升,。顯然,這種聚集程度隨著熱培養(yǎng)的增加而減少,，表明溶解改善。圖5中展開(kāi)了聚合的尾部以獲得更多細(xì)節(jié),。

 圖4:時(shí)間0(藍(lán)色),，1小時(shí)(紅色)， 6小時(shí)(黑色)

 圖5:聚合的蛋白質(zhì)尾部的擴(kuò)展視圖

數(shù)據(jù)3: 不同貯藏和加工條件下的蛋白質(zhì)

一名使用者提供了一種未知的蛋白質(zhì),。在FX-Nano 上分析了緩沖液和三種不同的制備/儲(chǔ)存條件,以確定聚合蛋白的粒徑和濃度,。緩沖液和蛋白樣品中> 0.19um顆粒的濃度見(jiàn)表1。圖形結(jié)果以差分計(jì)數(shù)格式(圖6)和累積格式(圖7)顯示,。

 表1:緩沖液和三種蛋白樣品的顆粒濃度

 圖6:差異分布

 圖7:累積分布

圖8和圖9顯示了相同的聚合蛋白數(shù)據(jù),，但Y軸的濃度以對(duì)數(shù)標(biāo)度表示，以更好地顯示大濃度范圍的結(jié)果,。

圖8: Differential distribution, log scale

圖9:Cumulative distribution, log scale

結(jié)論：

該Accuizer FX-Nano提供了一種分析工具, 能夠輕松量化蛋白質(zhì)聚集物的大小和濃度,。*的兩個(gè)傳感器方法涵蓋了廣泛的動(dòng)態(tài)范圍,，需要提供詳細(xì)的，高分辨率的aggre尾部視圖封閉的蛋白質(zhì),。準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)允許比較不同濃度的樣品的結(jié)果。SIS取樣器可以用于此應(yīng)用所需的小樣本量,。此外,，通過(guò)去除FX-Nano傳感器，該系統(tǒng)可以用于注射中USP <787>和<788>的標(biāo)準(zhǔn)顆粒物,。

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