【使用方法】

（一）探針配制

儲(chǔ)備液：

溶解1 mg CDCFDA于0.21 mL DMSO,，配制成10 mM儲(chǔ)存液,，分裝后-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融,。

工作液：

用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS稀釋儲(chǔ)備液至0.5-25 μM（根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整）,。

（二）細(xì)胞處理

懸浮細(xì)胞：

4℃離心（1000 g，3-5分鐘）,，PBS洗滌2次,，棄上清后加入1 mL工作液。

貼壁細(xì)胞：

yi酶消化后離心,，PBS洗滌,，棄上清后加入1 mL工作液。

（三）孵育與洗滌

孵育：37℃,、5% CO?條件下孵育15-45分鐘（避免過長導(dǎo)致假陽性）,。

洗滌：4℃離心（400 g，3-4分鐘）,，棄上清后PBS洗滌2次,，每次5分鐘。

（四）檢測

熒光顯微鏡：設(shè)置504 nm激發(fā)/529 nm發(fā)射濾光片,，觀察綠色熒光,。

流式細(xì)胞儀：使用FL2通道（525/50 nm）檢測，建議聯(lián)用死細(xì)胞染料（如PI）排除干擾,。

【技術(shù)參數(shù)】

化學(xué)名稱：5(6)-Carboxy-2'',7''-dichlorofluorescein Diacetate

中文名稱：5[6]-羧基-2',7'-二氯熒光素二乙酸酯

英文名稱：5-(6)-CDCFDA

CAS NO：127770-45-0

分子式：C25H14Cl2O9

分子量：529.28 g/mol

狀態(tài)：白色固體

激發(fā)波長：504nm

發(fā)射波長：529nm

純度：≥95%

儲(chǔ)存條件：-20℃避光干燥

【作用機(jī)制】

5[6]-羧基-2',7'-二氯熒光素二乙酸酯（5-(6)-CDCFDA）的作用機(jī)制分為以下三步,，依賴細(xì)胞代謝活性和膜完整性：

（一）細(xì)胞滲透與酯酶水解

被動(dòng)擴(kuò)散：探針以非極性形式自由穿過活細(xì)胞膜，死細(xì)胞因膜破損無法積累。

酯酶活化：胞內(nèi)非特異性酯酶水解乙酸基團(tuán),，生成帶負(fù)電荷的羧基熒光素（5-(6)-CDCFDA）,，無法穿透完整細(xì)胞膜，僅滯留于活細(xì)胞內(nèi),。

關(guān)鍵點(diǎn)：水解過程反映細(xì)胞酯酶活性，間接評估代謝功能,。

（二）熒光信號檢測

活細(xì)胞內(nèi)熒光產(chǎn)物積累,，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞活力正相關(guān)。

死細(xì)胞因膜通透性增加導(dǎo)致熒光泄漏,，可通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡定量分析,。

（三）多功能擴(kuò)展應(yīng)用

ROS檢測：二氯基團(tuán)可被ROS（如H?O?、·OH）氧化,，熒光強(qiáng)度變化反映ROS水平,。

pH傳感：pKa≈4.8，在酸性環(huán)境中熒光增強(qiáng),，適用于細(xì)胞器pH監(jiān)測,。

細(xì)菌活性檢測：通過膜通透性變化區(qū)分活/死細(xì)菌。

【相關(guān)的試劑】

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iFluor 860 succinimidyl ester iFluor 860 琥珀酰亞胺酯

iFluor 625 succinimidyl ester iFluor 625 琥珀酰亞胺酯

注意：本試劑用于科研領(lǐng)域,，其他用途概不適用,！

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