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細(xì)胞屬性：

方法簡介

實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠腎臟微血管內(nèi)皮采用膠原酶消化,，結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來,，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

質(zhì)量檢測

實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠腎臟微血管內(nèi)皮經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

細(xì)胞簡介：

大鼠腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離自腎臟,；腎臟是大鼠的重要器官，它的基本功能是生成尿液,，借以清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及某些廢物,、毒物，同時(shí)經(jīng)重吸收功能保留水分及其他有用物質(zhì),，如葡萄糖,、蛋白質(zhì)、氨基酸,、鈉離子,、鉀離子、等,，以調(diào)節(jié)水,、電解質(zhì)平衡及維護(hù)酸堿平衡。腎臟同時(shí)還有內(nèi)分泌功能,，生成腎素,、促紅細(xì)胞生成素、活性維生素D3,、前列腺素,、激肽等，又為機(jī)體部分內(nèi)分泌激素的降解場所和腎外激素的靶器官,。腎臟的這些功能,，保證了機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使新陳代謝得以正常進(jìn)行,。腎臟內(nèi)部的結(jié)構(gòu),，可分為腎實(shí)質(zhì)和腎盂兩部分。在腎縱切面可以看到,，腎實(shí)質(zhì)分內(nèi)外兩層：外層為皮質(zhì),，內(nèi)層為髓質(zhì)。腎皮質(zhì)位于腎實(shí)質(zhì)表層,，富含血管,，新鮮時(shí)呈紅褐色,，由一百多萬個(gè)腎單位組成。每個(gè)腎單位由腎小體和腎小管所構(gòu)成,，部分皮質(zhì)伸展至髓質(zhì)錐體間,，成為腎柱。腎髓質(zhì)位于腎皮質(zhì)的深面,，血管較少,，色淡紅，為10-20個(gè)錐體所構(gòu)成,。腎錐體在切面上呈三角形,。錐體底部向腎凸面，向腎門,，錐體主要組織為集合管,，錐體稱腎乳頭，每一個(gè)乳頭有10-20個(gè)乳頭管,，向腎小盞漏斗部開口,。在腎竇內(nèi)有腎小盞，為漏斗形的膜狀小管,，圍繞腎乳頭,。腎錐體與腎小盞相連接。每腎有7-8個(gè)腎小盞,，相鄰2-3個(gè)腎小盞合成一個(gè)腎大盞,。每腎有2-3個(gè)腎大盞，腎大盞匯合成扁漏斗狀的腎盂,。腎盂出腎門后逐漸縮窄變細(xì),，移行為輸尿管。腎單位是腎臟結(jié)構(gòu)和功能的基本單位,。腎小體包括腎小球和腎小囊,。腎小體內(nèi)有一個(gè)毛細(xì)血管團(tuán)，稱為腎小球,，腎小球是個(gè)血管球,。它由腎動(dòng)脈分支形成。腎小球外有腎小囊包繞,。腎小囊分兩層,，兩層之間有囊腔與腎小管的管腔相通。腎小管匯成集合管,。若干集合管匯合成乳頭管,，尿液由此流入腎小盞。微血管又稱毛細(xì)血管。分布于各種組織和細(xì)胞間的最微細(xì)的血管,。介于微動(dòng)脈和微靜脈之間,。平均直徑7-9微米，數(shù)量極多,，成網(wǎng)狀分布。管壁由一層內(nèi)皮細(xì)胞及一薄層基膜組成,，厚約0.5微米,。基膜外面有薄層結(jié)締組織,，其中有纖維細(xì)胞,、巨噬細(xì)胞和周細(xì)胞等。最細(xì)的毛細(xì)血管由一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞圍成管腔,，較粗的毛細(xì)血管由2-3個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞圍成,。分布于肌肉組織、神經(jīng)組織和結(jié)締組織中的毛細(xì)血管,，內(nèi)皮細(xì)胞間為縫隙連接（縫隙寬150埃）,，稱連續(xù)毛細(xì)血管；分布于內(nèi)分泌腺,、腎臟等處的毛細(xì)血管,，除有縫隙連接外，細(xì)胞本身有許多小孔,，（孔徑800-1000埃）,，稱有孔毛細(xì)血管；分布于肝,、脾,、骨髓及某些內(nèi)分泌腺的毛細(xì)血管，管腔擴(kuò)大,，稱血竇,。毛細(xì)血管的管壁薄、通透性大,、管徑細(xì)（8-10微米）,、數(shù)量多、血流速度慢,，這些特點(diǎn)使其成為血液與組織液進(jìn)行物質(zhì)交換的場所,，又稱交換血管。血竇（sinusoid）由毛細(xì)血管管腔擴(kuò)大而成,，竇壁的一般結(jié)構(gòu)與毛細(xì)血管壁相同,，由單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，內(nèi)皮細(xì)胞膜上有窗孔。不同器官的竇壁結(jié)構(gòu)各有差別,。脾血竇的內(nèi)皮細(xì)胞間有較寬裂隙,；肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞是不連續(xù)的，有較寬的細(xì)胞隙（0.1-0.5微米）,；肝,、脾血竇的基膜不完整或無基膜，通透性比毛細(xì)血管大,，較大的蛋白質(zhì)和血細(xì)胞可以通過,。肝血竇壁內(nèi)有枯否細(xì)胞，脾血竇內(nèi)外有巨噬細(xì)胞,，這兩種細(xì)胞都有吞噬能力,，可吞噬清除血液中的異物、細(xì)菌等有害物質(zhì),，是機(jī)體單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的重要組成分,。某些內(nèi)分泌腺的血竇有連續(xù)的基膜。

培養(yǎng)信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml）,，明膠（0.1%）

培養(yǎng)基：含FBS,、EGF、bFGF,、IGF,、VEGF、Heparin,、Hydrocortisone,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

大鼠腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng),，以此保證該細(xì)胞的優(yōu)良培養(yǎng)狀態(tài)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個(gè)瓶或皿,，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻,。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清,，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞,，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱,，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片,，待細(xì)胞長至80%時(shí)取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次,，4%的多聚甲醛固定爬片15min,，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min,。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min,，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫）,，PBS沖洗3次,，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min,，PBS沖洗3次,，每次3min。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗,，滴加在爬片上,，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次,，每次3min,。

7. 二抗孵育：選與一抗對應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上,，37°C濕盒中孵育30min,，PBS沖洗3次，每次3min,。

8. 將爬片周圍水漬吸干,，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察,，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色,。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化,，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán),。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上,，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干,。

11. 鏡檢觀察,。

公司產(chǎn)品：