大鼠棕色脂肪原代細(xì)胞

大鼠棕色脂肪細(xì)胞分離自棕色脂肪組織,；動(dòng)物體內(nèi)存在棕色和白色兩種脂肪，白色脂肪堆積在皮下,，負(fù)責(zé)儲(chǔ)存多余熱量,；棕色脂肪負(fù)責(zé)分解引發(fā)肥胖的白色脂肪，將后者轉(zhuǎn)化成二氧化碳,、水和熱量,，本身不儲(chǔ)存熱量。棕色脂肪組織呈棕色,，其特點(diǎn)是組織中有豐富的毛細(xì)血管,，脂肪細(xì)胞內(nèi)散著許多小脂滴，線粒體大而豐富,，核圓形,，位于細(xì)胞中央，這種脂肪細(xì)胞也稱為多泡脂肪細(xì)胞,。棕色脂肪組織在成年動(dòng)物極少,，新生兒及冬眠動(dòng)物較多，在新生兒主要分布在肩胛間區(qū),、腋窩及頸后部等處,。棕色脂肪組織僅在嬰兒時(shí)期發(fā)揮作用，它們堆積在新生兒肩胛處,，幫助維持體溫,。隨著年齡增長，棕色脂肪會(huì)逐漸消失,。終,，動(dòng)物體內(nèi)只殘存少量棕色脂肪細(xì)胞，分布于頸部和鎖骨,。脂肪細(xì)胞分為白色脂肪細(xì)胞和褐色（棕色）脂肪細(xì)胞,，常呈白色,，在嬰幼兒期大量增殖，到青春期數(shù)量達(dá)到巔,，此后數(shù)量一般不再增加,。細(xì)胞內(nèi)含有大量富含脂肪的小泡，稱為脂質(zhì)泡,，富含光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),。此外，還有一種褐色脂肪細(xì)胞,，在動(dòng)物體內(nèi)主要存在于肩胛骨間,、頸背部、腋窩,、縱隔及腎臟周圍,，含有高度團(tuán)縮的褐色脂肪，作用是將脂質(zhì)分解產(chǎn)熱,，調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)比例,。

產(chǎn)品名稱：大鼠棕色脂肪細(xì)胞

組織來源：脂肪

產(chǎn)品規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

包被條件：PLL(0.1mg/ml)

培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基,，含FBS、EGF,、Insulin,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：梭形,、多角形,、圓形

傳代特性：屬于終末分化細(xì)胞；屬于不增殖細(xì)胞群

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

大鼠棕色脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限,；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng),，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

方法簡介

實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠棕色脂肪采用膠原酶-酶聯(lián)合消化法獲得前脂肪細(xì)胞,，經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)制備而來,，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠棕色脂肪經(jīng)油紅O染色檢測,，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1、HBV、HCV,、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

1,、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,；

②加入2ml0.25%（T25瓶）,，使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化,；

③1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；若細(xì)胞還是貼壁,，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止,；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中,。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,，時(shí)間1min左右,，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基,。

3,、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次,，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化,；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞,；

④將凍存管放入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存,。

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘,，棄去上清液,，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中,，加入約 8ml 培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度,。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的 PBS 潤洗細(xì)胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái),，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出,，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液,，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻,。

4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí),，可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。下面 T25 瓶為類；

1. 細(xì)胞凍存時(shí),，棄去培養(yǎng)基后,，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細(xì)胞變圓 脫 落后,，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化,，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。