轉(zhuǎn)染級BAC PAC大型質(zhì)粒提取試劑盒（溶液型）

轉(zhuǎn)染級BAC/PAC大型質(zhì)粒提取試劑he 核酸提取

目錄號：31210

適用范圍：

適用于BAC/PAC/P1/Cosmid等大型質(zhì)粒制備

 試劑盒組成、儲存,、穩(wěn)定性：

本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果,。

儲存事項:

1.        第一次使用時，將試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液P1后（終濃度100μg /ml）置于4℃保存,。如果溶液P1中RNase A失活,，提取的質(zhì)粒可能會混雜有微量RNA殘留,，在溶液P1中補(bǔ)加RNase A即可,。

2.        內(nèi)毒素清除劑在4℃可保存一個月，如果要長期保存,，建議保存在－20℃!

3.        環(huán)境溫度低時溶液P2中SDS可能會析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀,，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清,，不要劇烈搖晃,，以免形成過量的泡沫。

4.        避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā),、氧化,、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品介紹：

常規(guī)的離心柱型質(zhì)粒抽提試劑盒并不適用于BAC/PAC/P1/Cosmid等大型質(zhì)粒DNA的抽提,。這主要是因為大型質(zhì)粒DNA分子量很大,，常常會超過100kb而且一般拷貝數(shù)低產(chǎn)量低，使用常規(guī)的離心柱吸附膜吸附效率和產(chǎn)量很低而且過膜會打斷這些大分子量的質(zhì)粒DNA,。本試劑盒采用改進(jìn)堿裂解法從培養(yǎng)菌中提取質(zhì)粒DNA,，采用du特的溶液配方和內(nèi)毒素清除試劑，只需要幾次簡單離心去除蛋白質(zhì),、多糖,、內(nèi)毒素、RNA等雜質(zhì),，獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA,。純化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的質(zhì)?？芍苯討?yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染甚至動物體內(nèi)實驗等對DNA純度要求很高的工作中,。純化后期過程均在1.5ml離心管中操作，方法簡單,，不需特殊設(shè)備,，無需過柱,，不用fenlv仿抽提,；基本可wan全回收細(xì)菌裂解釋放出的質(zhì)粒,，不必?fù)?dān)心質(zhì)粒DNA的丟失。本方法提取純化質(zhì)粒DNA,，對質(zhì)粒損傷小,，即使是10kb甚至100kb以上的大型質(zhì)粒或超大型BAC/PAC質(zhì)粒,，只要堿裂解法能夠提取,，就可以有效純化。此外溶液型的試劑可以按照比例放大縮小進(jìn)行小提/中提/大提,，最后可選擇任意小體積溶解質(zhì)粒,，濃度可高達(dá)3μg/μl。

產(chǎn)品特點：

1.        不需要使用有毒的苯fen,，lv仿等試劑,，也不需要乙chun沉淀?？焖?、 方便、從150 ml大腸桿菌LB((Luria-Bertani)培養(yǎng)液中,，可快速提取典型產(chǎn)量30-50μg高純度BAC質(zhì)粒DNA,，提取率達(dá)80-90 %。

2.        獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高，超螺旋比例高,，純度好,，可直接用于轉(zhuǎn)染、測序,、文庫等各種分子生物學(xué)實驗,。

3.        內(nèi)毒素含量極低（<10 EU/μg DNA）,，可直接應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染,。

注意事項：

1.        提取的質(zhì)粒量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度,、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?span>10kb 的大質(zhì)粒,，應(yīng)加大菌體使用量，同時按比例增加P1,、P2,、PⅢ的用量。

2.        提取大質(zhì)粒時操作動作要輕柔,，應(yīng)該使用剪大了開口的吸頭,，防止機(jī)械剪切對DNA的損壞。

3.        DNA沉淀液沉淀離心后,，可能看不到明顯沉淀,。如未見沉淀，擔(dān)心DNA丟失,，可保留上清液,，待完成全部操作后電泳鑒定，以確定是否獲得終產(chǎn)物（數(shù)百微克DNA離心沉淀在管的側(cè)壁上,，可能無法看到明顯團(tuán)塊）,。

4.        得到的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/ml DNA,。電泳可能為單一條帶,，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動位置不一造成,，與提取物培養(yǎng)時間長短,、提取時操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過95%,。

操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）

e  提示：將RNase A全部加入溶液P1中,，混勻，使用后置于2-8℃保存。

1.    取過夜培養(yǎng)菌150 ml左右菌液（最大不超過180ml-200ml）,，裝入合適的離心瓶中,，10,000 x g于4℃離心2 min沉淀菌體，wan全棄除上清,。

2.    加入5 ml 溶液P1,，充分混懸震蕩菌體沉淀，使其wan全分散開,，至無絮塊存在,。細(xì)菌懸液移入50 ml離心管中，室溫放置3~5 min,。 

如果有未che底混勻的菌塊,，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低,。

3.    加入5 ml 溶液P2,，輕輕顛倒離心管6~8次，室溫放置4-5 min,，使細(xì)菌wan全裂解,，溶液透明。

溫和地混合,，不要劇烈震蕩,，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時不應(yīng)超過5分鐘,！以免質(zhì)粒受到破壞,。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果菌體少,，很快清亮粘稠后就可以做下一步,，不是一定要準(zhǔn)確的5分鐘。如果未變得清亮,，可能由于菌體過多,，裂解不che底，應(yīng)減少菌體量,。

4.    加5 ml溶液PⅢ,，立即顛倒離心管6~8次，充分混勻,，至白色絮狀物產(chǎn)生,。上述裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g離心10~15 min，小心吸出上清,，移入新的50 ml離心管中,。

加入溶液PⅢ后應(yīng)該立即混勻,，以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀。

5.    加入10 ml 異丙chun,，顛倒離心管,，充分混勻。

6.    于4℃ 12,000~16,000 x g離心10 min,，小心棄去上清,，倒置輕輕瀝干殘余液體，加入3-5ml 70%乙chun漂洗一遍,，最高速離心5分鐘,，棄上清，晾干沉淀,。

DNA沉淀如果干燥過頭,，DNA將無法wan全溶解，但是如果乙chun沒有晾干揮發(fā)干凈,，殘留太多,，也會造成DNA無法wan全溶解,。

7.    加入1.4 ml 溶液P1wan全溶解沉淀團(tuán)塊,，注意附著在側(cè)壁上的質(zhì)粒沉淀雖然看不見，也要吹打側(cè)壁涮洗下來（大質(zhì)?？捎脤捒谖茌p輕吹打輔助溶解）,。然后將質(zhì)粒溶液轉(zhuǎn)入2個新的1.5 ml離心管中（每個700μl）。

可選步驟（一般不需要）：如果菌株RNA豐富有微量RNA殘留,，可在此步驟后將質(zhì)粒溶液 60℃孵育15 min消化RNA,。

8.    每管加入55μl雜質(zhì)清除液A，顛倒充分混勻后加入約0.1體積(約80μl)冰預(yù)冷的內(nèi)毒素清除劑,，顛倒旋轉(zhuǎn)7-10次（30秒左右）充分混勻,，冰浴或者冰上放置>=5分鐘，中間偶爾顛倒混勻幾次,。

內(nèi)毒素清除劑加入上清后,，上清會變得渾濁，但是冰浴后應(yīng)恢復(fù)清亮,。

注意：如果不需要去內(nèi)毒素用于轉(zhuǎn)染,，可在此步驟只加入55μl雜質(zhì)清除液A，充分混勻后冰上放置5分鐘,，離心后小心取上清轉(zhuǎn)入一個新管,，直接接步驟11。

9.    42℃水浴,，溶液又會變?yōu)闇啙?，顛倒混勻?span>42℃溫育5分鐘,。

10.  室溫14,000 x g離心5 min分相（溫度低時，內(nèi)毒素清除劑無法分相,，因此必須至少20℃以上室溫離心或者保證冬季轉(zhuǎn)頭溫度20℃以上）,。上層水相含DNA，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì),。將含DNA的上層水相轉(zhuǎn)移到新管（注意不要吸到藍(lán)色油狀層,，里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)），棄油狀層,。

溶液必須分為上下兩相,，否則應(yīng)重復(fù)步驟9-10。

11.  將上一步所得上層水相中加入等體積雜質(zhì)清除液B（約750μl）,，輕柔混勻,，4℃ 14,000 x g離心10 min，棄上清（注意不要丟失DNA）,，輕輕加入1 ml 70%乙chun洗滌,，離心棄上清，共兩次,，室溫倒置晾干5~10 min使乙chunwan全揮發(fā),。

12.  每個離心管加適量TE或者純水（50~100μl）溶解沉淀（可在37℃水浴中振蕩以輔助溶解）。要注意很多質(zhì)粒DNA可能附著在離心管側(cè)壁上,，即使看不見,，也應(yīng)該充分吹打側(cè)壁溶解回收質(zhì)粒DNA。

最后沉淀可以根據(jù)需要選擇任意小體積溶解,，這樣可以得到很高濃度的轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒DNA（高達(dá)3-5μg/μl）,。如果有需要，客戶也可以選擇更大體積溶解,。 

轉(zhuǎn)染級BAC/PAC大型質(zhì)粒提取試劑he 核酸提取