超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）試劑盒說明書（WST-8 法）

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用,，生成H2O2 和O2,。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是H2O2 主要生成酶,，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用,。

測定原理：

通過黃piao呤及黃piao呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O^2-.)，O^2-.可與WST-8 反應(yīng)產(chǎn)生水溶性染料甲臜,，后者在 450nm 處有吸收,；SOD 可清除O^2-.，從而抑制了甲臜的形成,；反應(yīng)液黃色越深,，說明SOD 活性愈低，反之活性越高,。

組成：

超氧化物歧化酶試劑盒 抗逆

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀,、離心機(jī),、移液器、96 孔板,、研缽,、冰和蒸餾水

粗酶液提取：

1,、細(xì)菌,、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s，重復(fù) 30 次）,；8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1,、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 450nm。

2,、試劑三的稀釋：將試劑三用蒸餾水稀釋 50 倍,，用多少配多少。（試劑三和蒸餾水 1：49 稀釋,。

3,、工作液配制：在試劑一加入 100μl 試劑二，充分混勻,。配好的試劑 4℃避光可保存一周,。（若一次性測定樣本較少,，可按照實(shí)際用量將試劑一和試劑二按照 20ml：0.1ml 的比例混勻配制）

4,、將一瓶試劑四用 5ml 蒸餾水溶解（溶解后一周內(nèi)用完）,。

5、樣本測定（在 96 孔板中依次加入下列試劑）

充分混勻,，室溫靜置 30min 后,，450nm 處測定各管吸光值 A。

注意事項(xiàng)

1,、試劑三為酶,，不可冷凍，使用時(shí)在冰上放置,。

2,、對照管只需要做一管。

3,、SOD 為什么有的樣本測定管大于對照管,，對照管數(shù)值在什么范圍？

對照管的范圍是 0.4-1,。對照管吸光值過低可能是（1）試劑三活性低,，可以適當(dāng)減少稀釋倍數(shù)；（2)沒有按順序加試劑,；（3）反應(yīng)時(shí)間不夠,，可以延長反應(yīng)時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間 30min 可以延長到 40min）。對照管吸光值過高可能是試劑三未按操作說明書稀釋相應(yīng)倍數(shù),。

若出現(xiàn)測定管大于對照管,，可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大，為了降低雜質(zhì)的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋 10 倍后再測,，通?？梢允箿y定正常。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),。

SOD 活性計(jì)算：

1,、抑制百分率的計(jì)算

抑制百分率＝(A 對照管－A 測定管) ÷A 對照管× 100%

盡量使樣本的抑制百分率在 10-90%范圍內(nèi)。如果計(jì)算出來的抑制百分率小于 10%或大于 90%,，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定,。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需將樣本用提取液適當(dāng)稀釋,；如果測定出來的抑制百分率偏低,，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測樣本。

2,、SOD 酶活性單位：在上述黃piao呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為 50%時(shí),，反應(yīng)體系中的 SOD 酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(U/ml)。

3,、SOD 酶活性計(jì)算：

（1） 血清（漿）SOD 活性(U/ml)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷V 樣

=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

（2） 組織,、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞SOD 活力計(jì)算：

a.  按樣本蛋白濃度計(jì)算

SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr)

=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷Cpr

需要另外測定,，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

b.  按樣本鮮重計(jì)算

SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(W ×V 樣÷V 樣總)

=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W c.按細(xì)菌或細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算

SOD 活力(U/10⁴ cell)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)

=0.04×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，0.2ml,；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01ml,；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml ,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬。

超氧化物歧化酶試劑盒 抗逆