去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒

NobleRyderD9928  去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒 Free Endotoxin Plasmid Extraction Mini Kit 

產(chǎn)品貨號(hào)：D9928

產(chǎn)品名稱：去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒 Free Endotoxin Plasmid Extraction Mini Kit

英文名稱：Free Endotoxin Plasmid Extraction Mini Kit

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：酶附件-20℃,，內(nèi)毒素清除劑4℃，其它試劑RT,，復(fù)檢期1年

NobleRyderD9928  去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞,，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。 離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效,、專一地吸附DNA,，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。 NobleRyder公司研制的內(nèi)毒素清除劑,，可最大限度地除去內(nèi)毒素,。從1-5ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中，可快速提取5-15μg高純度質(zhì)粒DNA,，提取率達(dá)85-90%,。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染等要求較高的實(shí)驗(yàn),，以及其他各種常規(guī)操作,，包括酶切、PCR,、測(cè)序,、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。

使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無(wú)水乙醇,，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽（每瓶需單獨(dú)加入45mL 無(wú)水乙醇）,。P1在使用前先加入RNase A（將試劑盒中提供的RNase A全部加入），混勻,，置于2-8℃保存,。如非指明，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心,。

第一次開(kāi)蓋使用后,，請(qǐng)將內(nèi)毒素清除試劑于2-8℃保存，可以縮短使用時(shí)的冰上預(yù)冷時(shí)間,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

操作步驟（僅供參考）:

1. 取 1-5mL 細(xì)菌培養(yǎng)物,，12000rpm 離心 1min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）,。

2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入200μL P1(請(qǐng)先檢查是否已加入RNase A）,，使用移液器或旋渦振蕩器che底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。注意：如菌塊未che底混勻,，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低,。

3. 向離心管中加入200μL P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解,。注意：混勻一定要溫和,，以免污染細(xì)菌基因組 DNA,，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時(shí)間不要超過(guò) 5min,，以免質(zhì)粒被破壞,。

4. 向離心管中加入200μL P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次,，充分混勻,，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min,，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中,，盡量不要吸出沉淀。注意：P3加入后應(yīng)立即混合,，避免產(chǎn)生局部沉淀,。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清,。

5. 加入上清1/5體積的冰上預(yù)冷內(nèi)毒素清除劑,，振蕩混勻溶液變渾濁，冰浴5-10min至溶液變清亮,。

6. 42℃水浴 5min,，不時(shí)振蕩，溶液又變渾濁,，12000rpm室溫離心5min,，溶液應(yīng)分為兩相，上層水相含質(zhì)粒DNA,，下層油相含內(nèi)毒素,。

7. 將含質(zhì)粒DNA的上層水相轉(zhuǎn)移至新管，棄下層油相,，注意不要吸入油狀相,。重復(fù)抽提三次,，即重復(fù)步驟5-7三次,。

8. 加入0.4倍上清體積的無(wú)水乙醇，充分混勻后加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中),，室溫放置2min,，12000rpm 離心1min，倒掉收集管中的廢液,，將吸附柱重新放回收集管中,。

9. 向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心1min,，棄廢液,，將吸附柱放入收集管中,。

10. 向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm離心1min,，棄廢液,，將吸附柱放入收集管中。

11. 12000rpm 離心 2min,，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘,，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn),，如酶切,、PCR等。

12. 將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中,，向吸附膜中央懸空滴加50-200μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液,，室溫放置2min，12000rpm離心1min,。

13. 為了增加質(zhì)粒的回收效率,，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 2min,，12000rpm 離心1min,。

注意事項(xiàng)：

1. 使用前請(qǐng)先檢查P2和P3是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象,，可在37℃水浴中加熱幾分鐘,，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。P2,、P3,、漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。

2. 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL,，體積過(guò)小影響回收效率,；洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍),，pH 值低于7.0會(huì)降低洗脫效率,，DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解,。

3. 如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量,，使用5-10mL過(guò)夜培養(yǎng)物,，同時(shí)按照比例增加P1、P2和P3的用量,，吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)時(shí)間,，以增加提取效率,。

4. DNA 濃度及純度檢測(cè)：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān),。得到的 DNA 可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度,。DNA 應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/mL雙鏈DNA,、40ug/mL單鏈DNA,。OD260/OD280比值應(yīng)為 1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液,，而使用去離子水,，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響吸光值,，但并不表示純度低,。

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